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Reglage de CP


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22 réponses à ce sujet

#1 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 16 août 2011 - 09:52

Bonjour le forum,

Je viens d'ajouter a mon microscope un systeme de contraste de phase. L'un d'entre vous pourrait-il m'expliquer dans le detail comment se regle le systeme ?

Merci d'avance,

Martin
  • 0

#2 speculoos

speculoos

    Procaryote

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Posté 16 août 2011 - 10:25

Bonjour le forum,

Je viens d'ajouter a mon microscope un systeme de contraste de phase. L'un d'entre vous pourrait-il m'expliquer dans le detail comment se regle le systeme ?

Merci d'avance,

Martin

Bonjour Martin,
beaucoup de membres utilisent un dispositif CP, et le gamme d'équipements est large.Il faudrait préciser la marque et le type de microscope, le type de condenseur, le marquage des objectifs et si tu dispose d'un oculaire (telescope) de réglage.
Pour ma part j'utilise un dispositif sommaire fournit par Paralux pour le L3000, en attendant de trouver mieux.
cordialement
  • 0

#3 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 17 août 2011 - 08:39

Bonjour Martin,

Félicitations pour ton achat.
Le réglage d'un CP est TRÈS simple!

Il suffit de faire coïncider l'anneau lumineux produit par le diaphragme situé au niveau du condenseur (anneau de phase) avec la lame de phase contenue dans l'objectif qui elle aussi à la forme d'un anneau.

A chaque objectif de phase correspond un anneau de phase du condenseur et pour bien voir ces anneaux, il faut une lunette de centrage que l'on met à la place d'un oculaire ou bien une position spéciale sur les microscopes "haut de gamme" (Lentille de Bertrand.

Pour entrer dans le détail, il faudrait connaitre le matériel que tu utilises.

Cordialement.
  • 0

#4 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 17 août 2011 - 04:27

Bonjour à vous,

merci pour vos réponses. Je dispose d'un microscope chinois (Amscope), auquel j'ai ajouté un kit chinois :-) . A vrai dire pour le moment, mes premiers essais ne sont pas très satisfaisants à mon goût.. Notez au passage que le SAV est néant. J'ai eu pour toute réponse à mes questions un conseil de "steeve" m'invitant à aller voir sur la toile car "there should be plenty resource online that can help you understand how to use the condenser". No comment n'est-ce pas ?

En ce qui concerne le kit, il s'agit d'une tourette avec un condenseur et 5 positions : Brightfield, x10, x20, x40 et x100 à immersion, qui s'accompagne de 4 objectifs plan achromatique PH de grossissement équivalents. Le kit est fourni avec une lunette de centrage et un tournevis auquel je ne vois aucune utilité...

Je pense avoir bien saisi le principe de superposition des anneaux : il faut superposer un anneau lumineux et un anneau sombre visibles au travers de l'oculaire (grâce à la lunette) après avoir au préalable fait la mise au point sur la préparation.

Pour régler le système, il me semble avoir plusieurs points d'entrée en jouant sur : la mise au point, la hauteur du condenseur et le centrage de l'anneau de phase du condenseur.

Lorsque je tente de superposer les anneaux, l'anneau lumineux, même parfaitement centré, ne remplit pas entièrement l'espace créé par l'anneau sombre. Est-ce que la superposition doit être parfaite ? Dois-je dans ce cas jouer sur l'axe vertical du condenseur ou y-a-il un point de réglage que j'ai omis ?

A quoi doit ressembler une image de diatomée sous contraste de phase ? Je tenterai ce soir de déposer une photo pour que vous me donniez votre avis sur la qualité du réglage.

En espérant avoir été clair dans mes explications, merci pour votre aide,

Martin
  • 0

#5 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 17 août 2011 - 05:24

Bonjour Martin,

Tu as un CP très complet félicitations !

Et tu es tout prés du but...

Il vaut mieux, avant de régler le CP régler le microscope selon Köhler

Ensuite procéder comme suit:

Faire la MAP sur une préparation et enlever la préparation.
NE PLUS TOUCHER A LA MAP.
Sous le contrôle de la lunette de centrage régler (centrer) l'anneau de phase (condensateur) correspondant à l'objectif.
Chaque anneau de phase, en principe se règle individuellement, c'est pourquoi, en principe, une petite clé est fournie avec le kit.
(Merci de nous présenter ce tournevis pour voir si c'est bien son usage)

La superposition des anneaux ne se fait jamais en jouant sur les vis de centrage du condenseur! Ce sont les vis de chaque anneau que l'on règle.

Dans ces conditions, les anneaux se superposent parfaitement en centrage et en épaisseur.

Toutefois, si les résultats ne sont pas bons ou si, malgré le réglage de Köhler, la taille (épaisseur) des annaux (pas leur diamètre!)est trop différente et donc qu'ils ne se recouvrent pas assez, il convient d'essayer de rattraper cette différence en jouant sur la hauteur du condenseur en agissant sur la crémaillère .Sans toucher à la MAP !

Si par malheur la MAP a été touchée, refaire le réglage avec la lame test.

Cordialement.
  • 0

#6 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

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Posté 17 août 2011 - 05:34

Bonjour Martin,

pour répondre à ta question voici une photo d'un exemple trouvé sur le NET. Je pense qu'il vaut mieux que l'anneau sombre couvre PLUS de la surface de l'anneau clair que l'inverse . Il se peut que les disques de phase du condenseur ne soient pas adaptés aux objectifs que tu as . Il est assez facile d'en faire d'autres en imprimant le motif sur des transparents pour imprimante jet d'encre, qui couvriront exactement l'anneau sombre.

Ps: le tournevis sert à régler les anneaux du condenseur (une fois pour toute) en agissant souvent sur 2 vis dont seules les tètes sont accesibles de part et d'autre du logement de l'anneau dans le disque du condenseur

amitiés,
JMC
CP1.jpg
  • 0

#7 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 17 août 2011 - 06:56

Bonsoir à tous,

suivant vos conseils j'ai tenté quelques réglages dont voici le résultat :

Gyrosigma.JPG

Qu'en pensez-vous ?

P.S : le tournevis est tout ce qu'il y a de plus basique, à tête plate, et ne sert pas au centrage.
  • 0

#8 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 17 août 2011 - 08:44

Re,

C'est un bon début !

Toutefois, je ferais remarquer que le CP ne s'utilise pas toutes les fois que l'on utilise le fond clair.
En effet le CP ne s'utilise avec un avantage sur les autres méthodes surtout quand l'on veut observer des objets de phase.
Les objets de phase ont la particularité de présenter de faibles différences d'indice de réfraction entre ses différents constituants ou avec le milieu.

Ainsi des objets trop épais ou colorés ne se prêtent pas bien à l'observation au CP.

Comme je suis très curieux, si le tournevis ne sert pas au centrage, comment as tu fait ?

Cordialement.
  • 0

#9 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 18 août 2011 - 10:05

Bonjour,

Ainsi des objets trop épais ou colorés ne se prêtent pas bien à l'observation au CP.


Pour la photo en question, j'ai fixé les diatomees dans du Naphrax : l'utilisation du CP aurait elle ete plus pertinente pour une preparation sans resine, plus "transparente" ?

Comme je suis très curieux, si le tournevis ne sert pas au centrage, comment as tu fait ?


Je vais essayer d'expliquer : les anneaux de phase sont fixés a la tourette par un systeme de collerette qui reagit comme un ressors en plaquant l'anneau. La collerette est en "sandwich" entre l'anneau (au dessus) et une piece en plastique (au dessous). Le tout est fixé a la tourette et est clairement fait pour etre manipulé avec les doigts. Il me suffit alors de pousser l'anneau dans la direction voulu a l'aide de la piece plastique, le maintien en position est ensuite assuré par la pression exercée par la collerette.

Je m'aprête a installer une luxeon pour remplacer mon eclairage a incandescence : cela pourrait il ameliorer significativement la qualite de mes images en CP ?
  • 0

#10 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 18 août 2011 - 10:55

Bonjour Martin et tous,

Merci pour l'explication du montage des anneaux de phase.
Je connaissais le principe mais pas dans cette application spécifique.

Pour les diatomées (d'après ce que j'en sais) le montage au Naphrax est une technique pour les diatomées préparées.
Il y a donc tout un travail de nettoyage avant le montage.

Ici apparemment, il y a montage au Naphrax un prélèvement brut, cela ne favorise pas la visibilité des détails des diatomées.

Dans ce cas j'aurais simplement examiné le prélèvement au CP in vivo entre lame et lamelle.

Cordialement.
  • 0

#11 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 18 août 2011 - 11:15

.
Ici apparemment, il y a montage au Naphrax un prélèvement brut, cela ne favorise pas la visibilité des détails des diatomées.


Non, il y a eu lavage au peroxyde d'hydrogene, plusieurs rincages a l'eau distillee, le tout entrecoupé de centrifugation. Une fois cela effectué, j ai déposé une goutte d'echantillon sur lamelle, laissé evaporé et deposé le Naphrax. Mais comme tu peux le voir, la technique n'est pas encore vraiment au point :-D
  • 0

#12 speculoos

speculoos

    Procaryote

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Posté 18 août 2011 - 11:46

Bonjour,
Pour la photo en question, j'ai fixé les diatomees dans du Naphrax : l'utilisation du CP aurait elle ete plus pertinente pour une preparation sans resine, plus "transparente" ?

Bonjour Martin,
Pour le réglage du CP après installation, je fais un test avec un spécimen simple, genre frottis buccal et le compare avec ceux postés par Dominique Voisin sur le forum, çà m'a permis de detecter un problème avec la lame du 40X.
  • 0

#13 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 18 août 2011 - 12:06

Bonjour Martin,
Pour le réglage du CP après installation, je fais un test avec un spécimen simple, genre frottis buccal et le compare avec ceux postés par Dominique Voisin sur le forum, çà m'a permis de detecter un problème avec la lame du 40X.


Bonjour Speculoos,

Merci pour ton conseil. Je vais comparer. Peux tu mettre le lien vers les images en question ? Merci !
  • 0

#14 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

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Posté 18 août 2011 - 12:09

Je m'aprête a installer une luxeon pour remplacer mon eclairage a incandescence : cela pourrait il ameliorer significativement la qualite de mes images en CP ?


Bonjour ,

probablement ... sur la photo il y a une dominante orange, peut être due à un excès d'infra rouge provenant de l'éclairage incandescent... Par contre il faut une led puissante (3 watts c'est bien ) ET son radiateur adapté !!

amitiés,
JMC
  • 0

#15 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 18 août 2011 - 12:18

probablement ... sur la photo il y a une dominante orange, peut être due à un excès d'infra rouge provenant de l'éclairage incandescent... Par contre il faut une led puissante (3 watts c'est bien ) ET son radiateur adapté !!


Bonjour Jean Marie,

Effectivement, c est orange, et tu dois avoir raison, ca doit venir de la lampe a incandescence, et peut etre aussi de la teinte du Naphrax ? (meme s il n y a qu une couche extremement fine ?). Pour pallier un peu a ce probleme, j'aurais pu jouer sur la balance des couleurs et intercaler un filtre IR, mais ce n'etait alors pas ma preoccupation..

Concernant la LED, j'ai puisé beaucoup d'info sur le forum et ai bien tenu compte du refroidissement de la LED, merci en tout cas pour le conseil preventif.
  • 0

#16 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 18 août 2011 - 05:06

Re,

Peux tu mettre le lien vers les images en question ? Merci !

C 'est ICI

Je précise qu'il ne s'agit pas d'un frottis.
D'ailleurs un frottis est un exemple de préparation non adaptée au CP.
Au contraire, le CP a été conçu pour l'examen de cellules vivantes.
La plupart du temps une cellule vivante est tuée par les colorants (même ceux qui sont dits vitaux).
De toute façon, la présence d'un colorant interférerait avec les phénomènes que l'on veut observer (exemple :divisions cellulaires)
La grande percée scientifique apportée par le CP est justement la possibilité nouvelle d'observer des cellules vivantes avec un très fort contraste.
Cela a valu un Prix Nobel à son auteur.

Un frottis au contraire est un étalement sur lame en vue de coloration.
Dans le TPM de Dominique, les cellules sont observées entre lame et lamelle dans leur "jus" pour celles qui sont observées au CP, les autres étant colorées.

Pour en revenir à la photo, on peut bien sûr y trouver des défauts, et un esprit critique les verra tout de suite, mais je voudrais quand même dire que c'est une préparation très "élaborée" qui a demandé beaucoup de travail et de patience. (Chose que je ne savais pas au début).
Pour une première photo sur le forum, c'est donc un exploit à signaler.

Félicitations.
  • 0

#17 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

    Nucléotide

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Posté 18 août 2011 - 10:50

Merci mPx pour tes encouragements. Si tu en as le temps, Je serai ravi que tu me décrives les défauts de l'image, afin que je puisse me concentrer dessus et tenter de les attenuer.

@ Speculoos : quel problème as tu détecté sur la lame ?
  • 0

#18 speculoos

speculoos

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Posté 19 août 2011 - 06:59

Re,
C 'est ICI

Je précise qu'il ne s'agit pas d'un frottis.
D'ailleurs un frottis est un exemple de préparation non adaptée au CP.

Bonjour Michel,

je pensais à d'autre photos que je garde en bookmark Contraste de phase
Notons tout de même qu'un frottis, vaginal, buccal ou autre forme d'étalement contient des cellules vivantes, d'autres mortes bien sûr!
Et qu'il soit destiné à être coloré en Diff-Quick ou MGG, il est nécessaire de le laisser sécher avant la fixation, sinon il y a risque de lessivage.
C'est pendant cette phase de séchage que l'observation en CP est très intéressante.
Prenons un frottis vaginal de chienne (detection d'oestrus), aux temps où l'on pouvait en réaliser et sans trop rentrer dans les détails, 2 facteurs sont à prendre en compte :
la forme des cellules : lisses, cornifées, parabasales ...
la nucléation : rapport de cellules nuclées et anuclées.

vous voyez ainsi l'intêt de la technique avec un peu de pratique, la fixation-coloration venant en confirmation ou pour conservation.

NB: cet examen de cytologie vaginale est considéré comme non-fiable si il n'est pas réalisé par un docteur vétérinaire.
  • 0

#19 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 19 août 2011 - 09:05

Bonjour Martin et tous,

Merci mPx pour tes encouragements. Si tu en as le temps, Je serai ravi que tu me décrives les défauts de l'image, afin que je puisse me concentrer dessus et tenter de les attenuer.

Je ne saurais expliquer les défauts (s'il y en a ) concernant la préparation des diatomées , cela dépasse mes compétences.
Il faudrait recueillir l'avis des Dominique et autres spécialistes...
Ce que je constate et qui affecte la lisibilité de l'image c'est que le prélèvement est trop concentré, trop encombré de débris divers.

Je ne sais pas si on peut les éliminer par traitement physico-chimique, en tout cas on peut les diluer avant le séchage sur la lame.

D'autre part, il me semble (à confirmer) que l'épaisseur de Naphrax est trop importante.
Peut-être faut-il mettre un objet pesant pendant le séchage du medium.

Cordialement.
  • 0

#20 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 19 août 2011 - 09:17

Bonjour Spéculoos,

C'est pendant cette phase de séchage que l'observation en CP est très intéressante.

En effet on peut examiner un frottis au CP, pendant le séchage, mais il n'y a plus rien de vivant et surtout il y a trop d’artéfacts.

Déjà en fond clair, on peut observer cette phase de séchage avec une augmentation du contraste, mais l'interprétation n'est pas facile.
Toutefois, pour des cellules épithéliales on peut reconnait de nombreux éléments et cela peut faire gagner du temps, mais je ne suis pas certain que ce protocole puisse être validé et certifié.

Cordialement.
  • 0

#21 Martin Sahaghian

Martin Sahaghian

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Posté 31 août 2011 - 10:45

Bonsoir à tous !

quelques réglages de CP, une préparation de lame un peu plus scrupuleuse et une luxeon plus tard, voici le résultat. Il s'agit de diatomées récoltées dans l'Yvette (Essonne) :
Diatomées Yvette.jpg

Cela ressemble bien à du CP ?

La prochaine fois, je tenterai le focus stacking :-D

P.S : En tout cas, je remercie les membres de ce forum qui ont partagé leur expérience du passage à l'éclairage LED. Le travail en vaut la chandelle et sans eux je n'y serai pas arrivé !
  • 0

#22 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 01 septembre 2011 - 07:19

Cela ressemble bien à du CP ?


Bonjour Martin,

Je le répète, je ne suis pas compétant en diatomées, mais je pense que c'est un sujet trop difficile pour faire les réglages de base du CP.
Je m'explique:

La préparation des diatomées pose déjà des problèmes (et ne parlons pas des séries focales (focus stacking ))
Je pense donc qu'en premier, il faut choisir des sujets plus simples comme les cellules jugales vivantes entre lame et lamelle proposées.
De plus dans ces préparations faciles, il y a très souvent la présence de bactéries, ce qui constitue un bon test.

On peut, avec ce test vérifier en fond clair, le réglage du microscope:

- Centrage de la source (LED).
- Réglage de Köhler ou d'un autre type d'éclairage (Critique, Oblique etc)
Ensuite, sans changer les réglages du microscope, on peut introduire le CP.
On peut alors comparer les deux mêmes images en Fond Clair et en CP .
On peut faire des allez-retour entre les deux méthodes pour améliorer éventuellement les réglages de base du microscope.

Ensuite, bien sûr, si ta recherche concerne les diatomées, on peut passer à l'examen des diatomées et on peut alors savoir si les défauts éventuels de l'image, viennent de la préparation des diatomées ou des réglages de base du microscope.

Ensuite, on peut, si on le désire ,passer aux séries focales car la technique d'empilage qui suivent la prise de séries focales, incorporent à leur tour des défauts.

Ce que je veux dire, c'est que pour juger du CP (comme de toute autre technique), il faut éliminer dans le test toute source d'erreurs ou d’artéfacts qui ne sont pas indispensables à ces tests.

C'est la méthode du pas à pas du plus simple vers le plus complexe.

Cordialement.
  • 0

#23 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

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Posté 01 septembre 2011 - 07:55

Bonjour,

j'y vois une nette amélioration, surtout en ce qui concerne la tonalité de couleur.. Peut être encore un manque de contraste (fond un peu clair) . Mais comme dit Michel c'est un peu difficile de se rendre compte sur des diatomées qui ne sont pas très plates. L’essai avec les cellules de l'intérieur de la joue sous lamelle donnerait sans doute une meilleure référence pour comparaison. Il ne faut pas oublier que le CP sert surtout pour des objets TRES transparents .

amitiés,
JMC
  • 0




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