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Caryotypage


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10 réponses à ce sujet

#1 Nadim1234

Nadim1234

    Nucléotide

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Posté 27 juin 2012 - 05:27

J'ai posté ce sujet dans la rubrique "sujets non classés mais ai ejsuite remarqué que seul les administrateurs pouvaient y poster des sujets... S'il est apparu, désolé pour l'erreur :)
Bonjour!
Mon abscence de ce forum ne marque en rien un désinteressement face au monde microscopique... Je visite d'ailleurs tous les jours ce magnifique forum et tiens à remercier toute la communauté de la merveilleuse passion que vous nous transmettez...
Depuis mes débuts en microscopie, j'ai toujours rêvé de réaliser un caryotype.. Après plusieurs recherches, je suis tombé sur plusieurs protocoles employant tous des techniques sophistiquées que je ne pourrait employer, notamment dans le cadre de la culture des leucocytes. Le reste de l'expérience paraît assez simple, mis à part quelques produits que je ne pourrais trouver. Au final, le protocole se résume à cela:
Faire une culture de leucocytes (assez long et compliqué)
Arrêter les cellules en mitose à l'aide de la colchicine
Les exposer à un milieu hypotonique sur une lame, pour les "gonfler" par choc osmotique
Les fixer (acide acetique et methanol)
Secher la lame et la colorer (giemsa)
Observer, photographier puis classer les chromosomes par paires...
Plusieurs problemes se posent:
- je ne pourrais faire une culture de leucocytes avec les techniques normales.. Je viens pourtant de tomber sur un article (en anglais) qui traite d'un nouveau protocole simple et accessible, mais serait-il approprié au caryotypage?? La technique est "l'instant leucocyte culture system" ( http://www.edigmbh.d...ilcs_info_e.pdf ) mais je n'ai rien trouvé qui traîte de son application au caryotypage...
- le protocole du caryotypage est parsemé de plusieurs centrifugations qui ne servent (apparemment) qu'à obtenir uniquement des leucocytes sur la lame.. Pourrais-je m'en passer?? (je ne cherche pas de résultats 'parfaits'...)
- La colchicine a (d'apres ce que j'ai lu..) les mêmes effets que le froid quand au blocage des mitoses.. Pourrais-je substituer le produit par un passage au refrigérateur?
Sinon, il s'avère que certains médicaments sont composés de colchicine, mais ce sont des plilules et ils contiennent surement d'autres produits...
- Quand au milieu hypotonique,pourrait-il etre composé d'eau distillée??
Pourriez-vous me conseiller?? Quelqu'un aurait-il déjà tenté cette expérience??

Merci beaucoup!!
  • 0

#2 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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  • 8 671 messages

Posté 27 juin 2012 - 09:56

Bonjour Nadim,

J'ai posté ce sujet dans la rubrique "sujets non classés mais ai ejsuite remarqué que seul les administrateurs pouvaient y poster des sujets... S'il est apparu, désolé pour l'erreur

C'est tout à fait sans importance !

Bravo de t'intéresser à ce sujet.
L'obtention de caryotypes par un amateur est un challenge tout à fait impressionnant et passionnant comme je les aime.
Les obstacles seront nombreux mais pas insurmontables avec de la patience.
Peut-être que la plus grande difficulté sera la prise de sang ?

Ensuite, il faut un minimum de matériel de laboratoire, donc de la place (un petit labo) et des produits chimiques.
Avant tout il faut être prêt à travailler en respectant les règles d’asepsie ce qui demande une grande concentration et d'excellentes habitudes.

L'obtention d'un bon cliché du caryotype, avant "découpage " et classification demande également un excellent microscope et un bon appareil de prise de vue.

Le choc hypotonique se fait avec KCl .
Je pense que la colchicine pure est irremplaçable mais il faut aussi stimuler les mitoses (phytohémagglutinine) et travailler présence d'antibiotiques.
Je ne pense pas que la centrifugation soit utile sinon, il faut utiliser de grandes quantités de sang.

Cordialement.
  • 0

#3 Nadim1234

Nadim1234

    Nucléotide

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Posté 28 juin 2012 - 06:58

Bonjour et merci pour votre réponse!
Je ne pourrais sûrement jamais me procurer de phytohémagglutinine (ce produit se trouve pourtant dans les graines d'haricot rouge, mais je doute (mais espère) que son extraction soit aussi simple qu'un entrainement a la vapeur ou qu'une infusion...). Sinon, la technique dont j'ai parlé (instant leukocytes culture system) ne semble pas employer ce produit (d'après le lien trouvé). Qu'en pensez-vous??
Si jamais tout ceci s'avèrerait impossible à réaliser, serait-il possible d'employer les méristèmes de liliacées en les soumettant au choc hypotonique? Si oui, ne faudrait-l pas d'abord dissocier les cellules??

Encore merci!

Modifié par Nadim1234, 28 juin 2012 - 07:04 .

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#4 patrice dx

patrice dx

    Batracien

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Posté 28 juin 2012 - 08:18

sur http://scialert.net/...ajps.2008.50.59 on trouve l'article : "Azarnoosh Jafari, Ali Asghar Maassoumi and Mohammad Farsi, 2008. Karyological Study on Bellevalia and Muscari (Liliaceae) Species of Iran. Asian Journal of Plant Sciences, 7: 50-59."

j'en cite l'extrait concernant la méthode utilisée pour caryotyper ces liliacées :

The materials were collected from the east, center and west of Iran in February until June 2003, 2004 (Table 2). Voucher specimen are deposited in herbarium of Tehran sciences and researches campus For karyotype analysis, a pretreatment at room temperature for three hours was usually applied before fixation of the root tips of six species of Bellevalia and Muscari either in 0.002 M 8-Hydroxyquinoline. After fixation in a cold mixture of ethanol and acetic acid (3:1), the following procedure involved the maceration in 1 N HCl at 60 for 5-8 min, washing in water, cutting off the meristems and squashing them in a drop of 45% acetic acid (Krahulcova, 2003). Chromosomes were described according to Levans terminology (Levan et al., 1964). Karyotypes were compared using total form percentage (Forni-Martin et al., 1994) and calculated the ratio of the longest to the shortest chromosome (Verma, 1980). Symmetry karyotypes were determined using Stebbins two way system (Stebbins, 1971).


ici on trouve le protocole pour effectuer des caryotypage de Phaenolopsis sp. L'article est destiné aux cultivateurs (professionnels ou amateurs) d'orchidées. : http://orchidvault.com/node/33. Le protocole est très détaillé. Il devrait être applicable, mutatis mutandi, à d'autres espèces et aux liliacées.

voir aussi cet article (fichier pdf) concernant une nouvelle procédure pour préparer des lames de chromosome en métaphase de Roses


cordialement,
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#5 patrice dx

patrice dx

    Batracien

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Posté 28 juin 2012 - 09:07

établissement d'un caryotype humain : vidéo didactique présentant le protocole de labo :

http://www.canal-u.t...ematologie.3234
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#6 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 29 juin 2012 - 03:52

Bonjour Patrice,

Une vidéo époustouflante !

Ce n'est qu'une technique parmi tant d'autres mais qui a l'avantage d'être visible par tous


Merci Patrice.
  • 0

#7 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 30 juin 2012 - 01:56

Bonjour Nadim, tous,

Je ne pourrais sûrement jamais me procurer de phytohémagglutinine (ce produit se trouve pourtant dans les graines d'haricot rouge, mais je doute (mais espère) que son extraction soit aussi simple qu'un entrainement a la vapeur ou qu'une infusion...). Sinon, la technique dont j'ai parlé (instant leukocytes culture system) ne semble pas employer ce produit (d'après le lien trouvé). Qu'en pensez-vous??


Tous les produits se trouvent chez Eurobio par exemple.
ILCS ne me parait pas tout à fait adapté à ce que tu veux faire.

Si jamais tout ceci s'avèrerait impossible à réaliser, serait-il possible d'employer les méristèmes de liliacées en les soumettant au choc hypotonique?

Cette dernière question change la donne du problème.
En fait que veux tu faire ?

S'il s'agit de faire un caryotypage humain, de nombreux protocoles existent (chaque laboratoire doit avoir le sien) et le film de Patrice est une des techniques le plus abouties, mais il existe des techniques qui vont plus loin que le simple caryotype et font appel à la fluorescence pour voir les bandes.

Si c'est pour observer des chromosomes, quelle qu'en soit l'origine, il y a infiniment plus simple que ce dont nous venons de parler.
La première observation à faire est celle des chromosomes polytènes (voir dans le forum), l'observation est très facile à faire (voir chromosomes géants dans le forum).
Ensuite il y a les chromosomes de méristèmes
Là encore, il n'y a pas besoin de culture et de produits spécifiques.

Si oui, ne faudrait-l pas d'abord dissocier les cellules?

Un écrasement contrôlé de la lamelle suffit (voir mitose , méristème sur le site)

Cordialement.
  • 0

#8 Nadim1234

Nadim1234

    Nucléotide

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Posté 02 juillet 2012 - 01:09

Merci a tous pour vos réponses!
Mon but est de réaliser un vrai caryotype, ayant déjà observé les mitoses des méristèmes... Mais les produits m'étant impossibles à trouver (je ne vis pas en France, Eurobio importerait-il hors de l'Europe??) j'ai demandé s'il était possivle d'obtenir, sur une préparation de méristèmes, des chromosomes étalés et non plus rassemblés sur la plaque équatoriale.
Encore merci!!
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#9 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 02 juillet 2012 - 02:39

Bonjour Nadim,

Les chromosomes humains sont nombreux et donc " inextricables " si on ne les étale pas.
Pour les chromosomes végétaux, ils sont pratiquement étalés en métaphase et anaphase, le problème pour les compter n'est donc pas le même.
Toutefois pour les cellules végétales, si on veut leur adapter la technique des leucocytes, cela ne me parait pas possible.
Les deux types de cellules ne sont pas les même.
La membrane cellulosique s'oppose á l'éclatement de la cellule et donc á l'étalement des chromosomes.

Par contre en écrasant bien les cellules déjá dissociées par des agents chimiques, on peut obtenir un bon étalement.
Est-ce suffisant pour toi ?

Cordialement.
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#10 Nadim1234

Nadim1234

    Nucléotide

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Posté 06 juillet 2012 - 06:18

J'ai déjà réalisé pluieurs préparations de mitoses végétales mais les chromosomes se chevauchent et le caryotypage impossible...
Encore merci!!!
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#11 Michel

Michel

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 06 juillet 2012 - 07:43

Bonjour Nadim,

Je crois q'il te faudra dans ce cas pratiquer la culture de protoplastes .

C'est pas gagné !

Amitiés
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