Aller au contenu


***** Bienvenue dans le forum MikrOscOpia ! *****
Photo

Microscope Ă fluorescence


  • Veuillez vous connecter pour rĂ©pondre
Aucune réponse à ce sujet

#1 SĂ©bastien Klein

SĂ©bastien Klein

    Poisson

  • Membre confirmĂ©
  • PipPipPipPip
  • 403 messages

Posté 04 septembre 2013 - 09:37

Bonjour Ă  tous,

 

je vous propose un petit sujet sur la fluorescence préparé par mes soins, c'est pas grand chose mais ça peut éclairer la lanterne

de certains.

 

Bonne lecture.

 

 

L’épifluorescence :

 

Quelques dates :

 

En 1852 la fluorescence est décrite pour la premiÚre fois par le scientifique Sir George G. Stokes.

Il explique le phénomÚne de la fluorescence en constatant que certains matériaux, tels que la fluorine (CaF2) et l'ouraline, qui émettent de la lumiÚre visible lorsqu'ils sont exposés au rayonnement ultraviolet.

 

En 1904, Köhler propose le premier microscope travaillant en ultraviolet. La rĂ©solution n’en est pas vraiment amĂ©liorĂ©e, mais cette dĂ©marche ouvre de nouvelles voies en cytologie, les Ă©lĂ©ments du noyau des cellules absorbant diffĂ©remment ces radiations. Ceci contribue au dĂ©veloppement ultĂ©rieur de la microscopie en fluorescence, d’abord primaire ou directement induite imaginĂ©e par Reichert en 1908, puis secondaire, due Ă  l’emploi plus efficace de fluorochromes, expĂ©rimentĂ©e par Haitinger en 1911. Quelques annĂ©es plus tard, en 1929, Bausch et Lomb crĂ©ent un microscope Ă  fluorescence adaptĂ© pour examiner des spĂ©cimens minĂ©raux et organiques.

 

Qu'est-ce que la fluorescence ?

 

Quand un organisme absorbe de la lumiĂšre et la rĂ©-Ă©met presque simultanĂ©ment, le phĂ©nomĂšne est appelĂ© fluorescence. Cette propriĂ©tĂ© est mise Ă  profit dans la microscopie de fluorescence. Le principe de base du microscope Ă  fluorescence est d'envoyer une lumiĂšre excitatrice, le plus souvent de la lumiĂšre ultraviolette, sur l'Ă©chantillon puis de sĂ©parer la lumiĂšre de fluorescence Ă©mise du reste de la lumiĂšre excitatrice afin que seule la fluorescence Ă©mise puisse ĂȘtre perçue par l'oeil ou tout autre dĂ©tecteur. C'est le seul mode de microscopie dans lequel l'Ă©chantillon (fluorescent ou rendu fluorescent) rĂ©-Ă©met sa propre lumiĂšre aprĂšs excitation.

De la lumiÚre ultraviolette UV d'une longueur d'onde précise est produite à partir d'une source UV

aprÚs passage à travers un filtre excitateur. Cette lumiÚre UV filtrée est envoyée sur l'échantillon qui

émet alors de la fluorescence tant qu'il est illuminé par la lumiÚre UV à une longueur d'onde précise.

AprĂšs excitation, l'Ă©chantillon Ă©met de la lumiĂšre avec des longueurs d'onde supĂ©rieures aux longueurs d'onde d'excitation. La lumiĂšre Ă©mise rayonne dans toutes les directions, indĂ©pendamment de la direction de la lumiĂšre excitatrice. Un filtre sĂ©lecteur laisse passer seulement la lumiĂšre fluorescente Ă©mise et arrĂȘte la lumiĂšre UV rĂ©flĂ©chie par l'Ă©chantillon. Le choix des filtres doit ĂȘtre fait avec prĂ©caution puisqu’il conditionne l’observation de l’élĂ©ment Ă  Ă©tudier.

 

La technique de microscopie à fluorescence est devenue un outil essentiel en biologie et dans les sciences biomédicales, due à des caractéristiques qui ne sont pas facilement disponibles dans les autres modes de microscopie optique traditionnelle. L'application d'un ensemble de fluorochromes permet d'identifier des cellules et des composants cellulaires avec un haut degré de spécificité. En effet, le microscope à fluorescence est capable de révéler la présence d'une seule molécule.

 

 

Principe schĂ©matisĂ© :

 

fluorointrofigure1.jpg

 

Les filtres :

 

fluorointrofigure2.jpg

 

Les colorations en fluorescence :

(Il existe beaucoup de colorations et de fluorochromes, ce qui va suivre n’est que la liste de ce que je connais, bien sĂ»r, j’ai la liste complĂšte des fluorochromes (table of fluorochromes ) mais je ne vais pas tout dĂ©tailler car ça serait trop long).

 

Coloration de l’ADN :

Colorant DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) molécule fluorescente qui se lie fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN.

EX λ : 350 nm

EM λ : 450 -490 nm

Coloration des mycobactĂ©ries :

 

Auramine et rouge thiazine ( Fluo-RAL).

 

Coloration des protĂ©ines (comme l’actine) :

 

GFP  (de l'anglais  Green Fluorescent Protein « La protĂ©ine fluorescente verte Â») protĂ©ine issue d’une mĂ©duse Aequorea victoria.

 

Les fluorochromes :

 

  • PerCP (peridrinin chlorophyl protein) est utilisĂ© dans des tests immunologiques tels que le tri cellulaire.

EX λ : 490 nm

EM λ : 675 nm

  • Fluoresceine est utilisĂ©e pour la confection de sondes pour les hybridations in situ en fluorescence (ou FISH).

EX λ : 495 nm

EM λ : 519 nm

  • Texas Red est utilisĂ© en histologie pour colorer certaines cellules.

EX λ : 589 nm

EM λ : 615 nm

  • Acridine orange colore l’ADN et l’ARN

EX λ : 503 nm

EM λ : 530 - 640 nm

 

L’autofluorescence :

 

  • PhĂ©nylalanine (acide aminĂ©)

EX λ : 258 nm

EM λ : 284 nm

 EX λ : 428 nm

EM λ : 663 nm

  • Vitamine A

EX λ : 346 nm

EM λ : 480 nm

  • Acide fĂ©rulique : c’est un acide organique prĂ©sent dans de nombreuses plantes. Ce dĂ©rivĂ© de l'acide cinnamique participe Ă  la synthĂšse de la lignine qui forme les parois des cellules vĂ©gĂ©tales. (voir photo dĂ©jĂ  rĂ©alisĂ©e)

EX λ : ? nm

EM λ :450 - 480 nm

 

(Il existe bien d’autres molĂ©cules et substances qui fluorescent d’elles-mĂȘmes mais je ne les ai pas encore testĂ©es).

 

Références :

Spring KR, Davidson MW; Introduction to Fluorescence Microscopy

SCÉRÉN - CNDP

 

 

 

 


  • 0




N'oubliez pas de consulter notre Magazine en ligne ... MIK-MAG