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FLUO

Test acridine orange

FLUO

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27 réponses à ce sujet

#1 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 23 novembre 2013 - 07:26

Bonsoir à tous,

Je me suis procuré de l'acridine orange (en poudre), donc je procède à quelques tests.

Voici le premier sur des cellules jugales :

Solution à 1% Acridine orange + eau déminéralisée,
Temps de coloration 1 minute.

Ex : 513 à 593 nm

Cellules jugale 2 acridine orange x250.jpg

Cellules jugale acridine orange x250.jpg

Vous en pensez quoi, avez vous des suggestions ?

D'autres essais sont à venir...

Amicalement
Seb

Modifié par Sébastien Klein, 23 novembre 2013 - 07:31 .

  • 0

#2 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 24 novembre 2013 - 03:25

Bonjour Seb,

 

Je trouve cela tres bien.

Mis à part le côté esthétique, voyons ce que nous apporte vraiment cette technique.

 

Dans l'image, il y a beaucoup de noir, donc pas d'information.

Dans les parties colorées, que voit-on?

 

Il suffit de supprimer le noir qui ne sert à rien en mettant l'image en négatif.

Bien sûr les couleurs sont inversées, mais leur intensité ne change pas.

On voit bien mieux ce qui se passe.

 

 

Voici le résultat :

 

 

CB1.jpg

 

J'ai agrandi de 50% une cellule pour mieux distinguer les détails "au pixel près" (comme dans la pub   :) )

 

CB.jpg

 

On voit quand même qu'il y a peu de photons et donc pas mal de bruit qui nuit à la résolution.

Mais si on connait la spécificité des colorants utilisés, on peut quand même en tirer des conclusions.

 

Cordialement.

 


  • 0

#3 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 24 novembre 2013 - 08:55

Bonsoir Tryphon,

L'acridine orange sert à marquer l'ADN et l'ARN en fluorescence, c'est la première fois que je l'utilise..

Amicalement
Seb
  • 0

#4 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 25 novembre 2013 - 09:31

Bonjour Seb,

 

On voit bien le marquage du noyau !

Par contre, pour les autres cibles, c'est quoi ?

Des mitochondries ?

Des bactéries?

 

Un grossissement plus important (sous entendu avec une meilleure résolution), permettrait de les différencier.

Tu es au maximum ?

 

Amiriés.


  • 0

#5 Sébastien Klein

Sébastien Klein

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Posté 25 novembre 2013 - 12:32

Bonjour Michel,

 

C'est la première fois que j'utilise l'acridine orange, je sais juste que ça marque l'ADN et l'ARN comme je l'ai dis plus haut.

Je peux passer au 400 et 1000, je poste tout ça dés que possible.

 

 

Merci

Seb


  • 0

#6 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 30 novembre 2013 - 09:33

Bonjour Michel et à tous,

 

Voici deux nouvelles photos.

 

 

x400

Cellules jugale acridine orange x400.jpg

 

 

 

Suite.....

 



x1000 oil

 

Cellules jugale acridine orange x1000.jpg

 

 

Effectivement Michel on dirait bien que l'acridine orange a marqué les bactéries, à confirmer ????

 

 

Curieusement

Seb


  • 0

#7 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 30 novembre 2013 - 11:21

Bonjour Seb,

C'est tout à fait çà, des bactéries communes de la bouche.

Jugales.jpg


On se rend bien compte que la profondeur de champ est très faible.
Il faut que je réfléchisse à ce phénomène bien mis en évidence en nuances de gris sur une image inversée.

J'aimerais connaitre ton montage optique, pour voir s'il n'y a pas moyen de supperposer deux images, une en fond clair, l'autre en fluo?

Cordialités.

Psss.. Cliquez deux fois successivement sur l'image pour la voir en plein format, c'est mieux !

Vous devez voir la photo à cette échelle :

détail1.jpg



J'ai remarqué une chose :

25%.jpg


Tu as probablement une trace de doigt sur un filtre dans la zone du rectangle.
On voit que dans cette zone l'image est plus floue et il y a des crètes parallèles...
C'est visible sur les deux clichés .

A+
  • 0

#8 Sébastien Klein

Sébastien Klein

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Posté 30 novembre 2013 - 11:42

Bonjour Michel,

 

Confirmation après coloration de Gram

 

Cellules jugale 2 acridine orange x400.jpg

 

 

 



Cellules jugale Gram x 400.jpg

 

Je comprends pas, tu veux savoir quoi sur mon montage optique ??

 

Amitiés

Seb


  • 0

#9 Sébastien Klein

Sébastien Klein

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Posté 30 novembre 2013 - 11:49

Ce n'est pas des trace de doigts (en fin je crois) je l'ai vu aussi tout à l'heure, regarde la dernière photo en FLUO avant celle en fond clair, il n'y a plus rien, en fait je prenais mes photos en fluo lumière du labo allumé, j'ai cherché un moment ce matin d’où cela venait..... une fois dans le noir ça disparait ....

 

Je vais refaire une coloration et poster deux photos identique une en fluo et l'autre en fond clair.


  • 0

#10 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 30 novembre 2013 - 12:46

Voici les photos, fond clair / fluo

 

x250

 

Cellules jugales acridine orange 2 x250.jpg

 

 



Cellules jugales acridine orange 1 x250.jpg

 

 

 

 



x400

 

Cellules jugales acridine orange 2 x400.jpg

 



Cellules jugales acridine orange 1 x400.jpg



x1000



Cellules jugales acridine orange 2 x1000.jpg



Cellules jugales acridine orange 1 x1000.jpg

 

Voila..

 

Seb


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#11 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 30 novembre 2013 - 03:32

Insérer une citation
Je comprends pas, tu veux savoir quoi sur mon montage optique ??

C'est simple, quand je vois une photo au microscope, j'essaye de comprendre quel est le microscope et comment il est configuré. Par où arrive la lumière, où sont les filtres, quels sont les accessoires utilisés, bref, comment il est configuré.
Comment est fixée la camera, l'appareil photo etc etc .
Une photo valant souvent mieux qu'un long discours.

Je vois à peu près ce quest un Leitz dialux 20 EB, mais cela ne m'éclaire pas suffisamment quand je me pose des questions.
Le mieux est d'indiquer le matériel dans la signature, c'est ton cas, et encore mieux avec un lien qui fait voir le matériel.

A+

NB x1000.jpg

Cliquez 1 fois pour agrandir et 1 fois four Zoomer


  • 0

#12 Vardar

Vardar

    Ciliate lover

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Posté 30 novembre 2013 - 05:24

Tryphon en fluo quels sont les filtres ?


  • 0

#13 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 30 novembre 2013 - 08:04

Vardar,je n'ai pas compris la question.


  • 0

#14 Vardar

Vardar

    Ciliate lover

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Posté 01 décembre 2013 - 02:51

ma question est naïve techniquement

je ne connais pas bien la technologie

en bref: utilises tu un filtre pour l'excitation ou ta source est elle précise (en longueur d'onde style laser, led, etc...)

pour la visualisation quel est ton filtre d'émission ?


  • 0

#15 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 01 décembre 2013 - 03:36

D'accord, je comprends mieux.

 

Pour ma part, je ne fais pas de la fluo.

J'ai des microscopes qui en font, mais je n'ai jamais eu l'occasion de les utiliser. (Confus  :mellow:  )

 

Je ne suis pas non plus spécialiste de la chose, (et pour cause) .

Je connais vaguement le principe :

 

Exciter une molécule fluorescente que l'on a fixée sur une cible choisie (par exemple le cytoscquelette ) avec des UV puis filtrer les UV avant qu'ils n'aillent léser l'oeil.

Seules les structures qui ont fluorescées, c'est à dire qui ont réémis des photons dans le visible, sont visibles sur fond noir .

 

Ensuite, il y a des filtres de différentes longueurs d'onde en fonction des colorants choisis.

 

Je ne peux pas en dire plus.

 

Cordialement.


  • 0

#16 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 01 décembre 2013 - 06:01

Bonsoir Michel et Vardar,

 

Vardar pour les filtres cela dépend de ce que tu souhaites faire ?? on choisit le filtre en fonction du fluorochrome utilisé...   j'ai écris un petit article sur la fluorescence ici : http://forum.mikrosc...hl=fluorescence

 

 

Michel voici mon microscope.

 

DSC_3159.jpg

 

 

 

Amicalement

Seb

 

 

 

 


  • 0

#17 Vardar

Vardar

    Ciliate lover

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Posté 01 décembre 2013 - 08:30

D'accord, je comprends mieux.

Pour ma part, je ne fais pas de la fluo.
J'ai des microscopes qui en font, mais je n'ai jamais eu l'occasion de les utiliser. (Confus :mellow: )

Je ne suis pas non plus spécialiste de la chose, (et pour cause) .
Je connais vaguement le principe :

Exciter une molécule fluorescente que l'on a fixée sur une cible choisie (par exemple le cytoscquelette ) avec des UV puis filtrer les UV avant qu'ils n'aillent léser l'oeil.
Seules les structures qui ont fluorescées, c'est à dire qui ont réémis des photons dans le visible, sont visibles sur fond noir .

Ensuite, il y a des filtres de différentes longueurs d'onde en fonction des colorants choisis.

Je ne peux pas en dire plus.

Cordialement.

En fait je me suis trompé ma question était pour Sébastien
Concernant le principe de la fluo ça va (je l'enseigne)
Ma question pour Seb est donc: quels sont les filtres utilisés ?
L'acridine fluoresce bien avec les filtes FITC (ex 480/Em 530) est ce le cas ?

Modifié par Vardar, 01 décembre 2013 - 08:31 .

  • 0

#18 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 01 décembre 2013 - 08:56

Ok.....

 

Alors dans mon premier post je dis "Ex : 513 à 593 nm" je me suis trompé, j'ai utilisé le filtre de λ 435 - 480 nm, donc oui pour le FITC.

 

Vu que tu enseignes la fluo, j'ai une question, as-tu déjà utilisé les filtres en 655 nm à utilisé avec le fluorochrome Qdot ?

en fait on m'en a donné un neuf de chez OMEGA (400$) il est installé (je peux avoir 3 filtres dans le touret) mais je n'ai jamais pu l'essayer, je crois qu'il peut servir en immunofluorescence avec ce fameux Qdot..

As-tu plus d'info ?

 

Curieusement

Seb


  • 0

#19 Vardar

Vardar

    Ciliate lover

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Posté 02 décembre 2013 - 01:08

Ok.....

Alors dans mon premier post je dis "Ex : 513 à 593 nm" je me suis trompé, j'ai utilisé le filtre de λ 435 - 480 nm, donc oui pour le FITC.

Vu que tu enseignes la fluo, j'ai une question, as-tu déjà utilisé les filtres en 655 nm à utilisé avec le fluorochrome Qdot ?
en fait on m'en a donné un neuf de chez OMEGA (400$) il est installé (je peux avoir 3 filtres dans le touret) mais je n'ai jamais pu l'essayer, je crois qu'il peut servir en immunofluorescence avec ce fameux Qdot..
As-tu plus d'info ?

Curieusement
Seb

Il existe en fait trois types de fluorophores Qdots qui émettent respectivement à 525,545 et 565 nm
voici le spectre à 565 nm

Tu pourras donc utiliser Qdot à deux couleurs différentes (avec ton FITC et le nouveau). Ce produit très cher sert essentiellement pour les cellules en fluorescence. C'est très joli à voir.
Pour ma part je ne l'utilise pas (ou très peu).
Je travaille (ou plutôt j'ai travaillé) beaucoup la technologie de FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer notamment pour la mise au point de test de Binding ou d'activité enzymatique. Donc peu de microscopie.

Juste une r

 

 Il semble que tu colore l'ADN en vert et les lysosomes en Orange (l'acridine est un bon marqueur lysosomial car il est sensible au pH ; acide dans ce cas)


Modifié par Vardar, 02 décembre 2013 - 01:04 .

  • 0

#20 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 02 décembre 2013 - 01:39

Bonjour Vardar et tous,

 

Merci pour les infos sur le Qdot, effectivement j'ai vu les prix chez life technologie c'est super chère !!!

 

Pour l'acridine orange c'est la première fois que je l'utilisais, j'ai utilisé 1g/100ml et je sais pas du tout si c'est correct, je savais qu'il fallait un pH +/- de 5 donc j'ai utilisé de l'eau déminéralisée qui est à peut près de 5.5.

 

En revanche pour l'ADN j'ai déjà utilisé le DAPI, EX max à +/- 360 nm, EM +/- 460 nm, il faut que j'en commande un de ces jours pour vous faire quelques clichés. Il existe aussi des contre-colorations, en voici une le DAPI + phalloïdine voir photo ci-dessous.

 

DAPI-002-Phalloidin-559px5.jpg

 

 

le DAPI colore l'ADN et la phalloïdine colore les filaments d'actine.

 

 

Amitiés

Seb

 

 

 


  • 0

#21 Vardar

Vardar

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Posté 06 décembre 2013 - 09:40

Jolie photo ! c'est de toi ?

Je cherche de l'acridine orange également pour tester mon dispo fluo bricolé avant d'aller plus loin.


  • 0

#22 Sébastien Klein

Sébastien Klein

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Posté 06 décembre 2013 - 09:58

Bonjour vardar,

 

Malheureusement c'est pas de moi. :(

 

Il te faut combien de grammes ? je peux peut être te dépanner ??

 

Amicalement

Seb


  • 0

#23 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 06 décembre 2013 - 11:41

Bonjour,

Oui cette photo a été faite avec un Zeiss Axio Observer Objectif 20 X (c'est peu !)

Voici le microscope :
 

AxioObserver.jpg

On ne voit pas beaucoup de détails sur les photos, c'est surtout pour illustrer l'avantage de la contre- coloration à la phalloïdine.

La phalloïdine est un poison, c'est un des principes actifs de l' Amanite phalloïde , champignon mortel.

Pour ceux que çà intéresse , voir cet article sur le syndrome phalloïdien qui nous montre que tout ce qui est naturel , n'est pas nécessairement bon pour la santé.
Alors quand j'entend, c'est naturel...

Naturellement !


  • 0

#24 Vardar

Vardar

    Ciliate lover

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Posté 06 décembre 2013 - 12:33

Bonjour vardar,

 

Malheureusement c'est pas de moi. :(

 

Il te faut combien de grammes ? je peux peut être te dépanner ??

 

Amicalement

Seb

C'est sympa. Un gramme suffirait. J'ai vu que Marcel Lecomte en avait je lui ai demandé; en attente de sa réponse.


  • 0

#25 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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Posté 06 décembre 2013 - 02:36

Ok,

 

si jamais Marcel Lecomte t'envoie une réponse négative, dit le moi, je t'enverrai 1 gramme gracieusement, ça sert à ça aussi un forum .. :D

 

 

Amicalement

Seb


  • 0

#26 scrophulaire

scrophulaire

    Procaryote

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Posté 07 décembre 2013 - 06:32

Bonjour,

 

je suis également intéressé par l'acridine pour  réaliser la coloration de Wacker W3a. Je suis pret à acheter deux grammes.

 

 

Cordialement


  • 0

#27 Sébastien Klein

Sébastien Klein

    Poisson

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  • 403 messages

Posté 08 décembre 2013 - 09:06

Bonjour Scrophulaire,

 

On en parle en MP.

 

@+

Seb


  • 0

#28 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Procaryote

  • Membre confirmé
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  • 139 messages

Posté 26 septembre 2016 - 02:15

je suis également intéressé par l'acridine pour  réaliser la coloration de Wacker W3a. Je suis pret à acheter deux grammes.

Bonjour Scrophulaire,

 

il-y-a-un petite confusion. On a parlé du acridine orange mais dans la formule Wacker on a l´acridine rouge c´est vraiment une autre chose!


  • 0





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