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Un même sujet, six techniques d'éclairages, enseignements


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4 réponses à ce sujet

#1 pablito

pablito

    Homo sapiens microscopicus

  • Co.Admin
  • 1 289 messages

Posté 13 février 2016 - 09:26

Bonsoir, 

 

Fort de mes tâtonnements précédents, je fais un post plus "abouti" sur les techniques d'éclairages, leurs caractéristiques, leurs apports respectifs.

Le sujet est le même que dans mes premiers posts, une feuille de mousse, cela a l'avantage d'être simple, de ne pas bouger, d'être faisable par tous sans préparation.

Le sujet, bien sûr, est le même pour les six éclairages choisis, 

L'objectif également, contrairement à mes posts précédents, je suis au X20 sur ces photos.

Enfin, je fais un comentaire simplificateur de vulgarisation de chacune des techniques, pour pousser il faut aller loin dans les lois d'optiques et ce ne sera pas l'objet ce soir : la démonstration se veur volontairement simplificatrice.

 

Les 6 éclairages testés sont

 

1. Fond clair

2. Fond noir

3. Lumière polarisée analysée

4. DIC

5. combinaison fond noir et lumière polarisée analysée

6. combinaison fond noir + DIC

 

A chaque fois, je présente une photo d'ensemble, et un agrandissement d'une zone de cellules. Bien sûr, à chaque fois, la zone concernée est strictement la même.

 

 

1. Fond clair

 

C'est la base du microscope. On est ici en lumière transmise (qui traverse l'objectif) au contraire de l'épiscopie (éclairage par dessus) pas testé ce soir.

Plus la zone est épaisse, plus c'est noir et moins on voit de détails; c'est le cas des zones de vaisseaux et les replis de la feuille de mousse ce soir.

Bien réglé, en principe, le pouvoir de résolution (précision de détails) est optimale, mais la sensation de relief est nulle et on voit vraiment que en transparence.

Avec cette technique, pour mettre en évidence des structures (parois cellulosiques par exemple), les techniques de coloration prennent tout leur sens. Nous n'en avons pas fait ce soir, bien sûr, on parle des techniques d'éclairage.

 

Dans la première photo, on voit qu'on perd des informations dans les zones épaisses, qui paraissent sombres et peu contrastées.

Dans la deuxième photo, on voit les cellules et leur contour, mais mal défini, car sans coloration la paroi cellulosique est peu contrastée.

Cela étant, on voit pas trop mal un contenu cellulaire.

 

mousse fond clair _V9.jpg

 

mousse fond clair _V91.jpg

 

 

 

2. Fond noir.

 

Optiquement, c'est très simple : un disque est placé sur le centre du circuit lumineux (un simple bout de plastique ou de carton !!!), en amont du condensateur. Il s'agit d'éliminer les rayons qui rentrent en direct du condensateur sur l'objectif. Le fond devient noir.

Le sujet est maintenant éclairé par des rayons en biais uniquement, l'intensité lumineuse est beaucoup plus faible, et les objets lumineux peuvent avoir presque un halo.

J'ai mesuré ce matin, avec mon fond noir, la quantité de lumière disponible a été diminuée d'un facteur 16 environ.

A l'inverse du fond clair, les zones épaisses qui reçoivent de la lumière latérale sont plus lumineuses.

L'observation est donc complémentaire du fond clair : 

Meilleur aperçu de la paroi cellulosique (plus épaisse donc plus claire) 

Meilleure précision des zones épaisses.

Perte d'information dans le contenu cellulaire.

 

mousse Fond Noir _V9.jpg

 

mousse Fond Noir _V91.jpg

 

 


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#2 pablito

pablito

    Homo sapiens microscopicus

  • Co.Admin
  • 1 289 messages

Posté 13 février 2016 - 09:51

3. Lumière polarisée

 

La lumière polarisée consiste à placer deux filtres, un en amont de l'objet observé, et un en aval.

Ces filtres orientent l'onde lumineuse dans une seule direction, en les croisant, on parvient à éteindre complètement la lumière directe. Le fond est noir, ici, et le résultat de l'observation dépend de la capacité aux objets en observation à dévier les rayons. 

La quantité de lumière disponible est faible.

Mesurée ce matin à plus de 64 fois moins que l'objet en lumière directe.

Le résultat observé est difficile à prévoir, il dépend des qualités optiques : un cristal peut prendre des couleurs variées selon sa réfringence.

L'épaisseur n'est plus ici un juge de paix absolu.

 

Dans le cas qui nous concerne, la couleur est devenue plus verte, le contenu cellulaire est très effacé voir absent, c'est jusqu'à présent la technique qui permet de voir le mieux les parois cellulaires.

Pas trop éloigné du fond noir, dans cet exemple.

 

Mousse LPA _V9.jpg

 

Mousse LPA _V91.jpg

 

 

4. DIC

 

Le DIC est un dispositif de filtre qui s'ajoute à la lumière polarisée. DIC veut dire Differential Interférence Contrast, sans aller dans la technique ce soir, vue déjà sur le forum, il s'agit entre un premier filtre polarisant à 45 degré et l'objet, d'introduire un filtre dédoublant le faisceau lumineux, puis un autre  entre l'objet et le deuxième, pour reconstituer ce rayon.

Le réglage est donc complexe, car il faut l'alignement de 4 filtres.

L'avantage du DIC n'est pas d'augmenter la résolution, mais le contraste perçu.

Dans notre exemple ce soir, c'est vraiment très net.

Nous avons des informations sur la structure de la paroi cellulaire, sur le contenu des cellules, que nous n'avions pas précédemment.

 

mousse DIC _V9.jpg

 

mousse DIC _V91.jpg

 

 

 

 

 


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#3 pablito

pablito

    Homo sapiens microscopicus

  • Co.Admin
  • 1 289 messages

Posté 13 février 2016 - 10:02

5. Combinaison fond noir et polarisation

 

Il faut un éclairage puissant, mes mesures indique 1000 fois moins de lumière que sur une source fond clair.

Le rendu évite, je l'ai souligné précédemment, un excès de lumière sur des tâches lumineuse caractéristiques du fond noir.

Cela étant, si le résultat est plus lisible, il n'apporte pas d'informations plus probantes qu'avec les techniques simples précédentes.

Mais on voit bien le contenu cellulaire, c'est peut être la meilleure perception de ce contenu à par le DIC. Pas mal, non ?

Il reste qu'il faut un éclairage très puissant : 100 W halogène mini, par exemple.

 

mousse fond Noir et LPA_V9.jpg

 

mousse fond Noir et LPA_V91.jpg

 

 

6. combinaison DIC et fond noir.

 

Pas grand chose à dire sur cet exemple, le résultat est impresionnant à l'oculaire, plus que sur les images présentées ici.

Le relief, en effet, est très visible. Mais pas d'informations complémentaires par rapport au DIC dans notre sujet observé.

 

mousse DIC et Fond noir _V9.jpg

 

mousse DIC et Fond noir _V91.jpg

 

 


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#4 jmaffert

jmaffert

    Batracien

  • Membre confirmé
  • PipPipPipPipPip
  • 594 messages

Posté 14 février 2016 - 10:23

Bravo, très didactique, et belles images, comme d'habitude. Il ne te manque plus que le contraste de phase et la fluorescence...

 

Comme tu le dis, les différentes techniques sont utilisées pour voir des choses différentes.

 

Classiquement on sépare les objets "d'amplitude" et les objets "de phase"

 

Un objet "d'amplitude" est un objet dont les différentes parties atténuent plus ou moins la lumière, soit dans toutes les longueurs d'onde (objet gris) soit certaines longueurs d'onde (objet coloré).

 

Un objet "de phase" est un objet transparent dont les différentes parties n'ont pas le même indice de réfraction, ce qui est le plus souvent le cas. En microscopie on regarde des objets minces (ou des coupes), qui sont souvent peu absorbants à cause de leur minceur. C'est encore plus net aux forts grossissements où la faible profondeur de champ oblige à regarder des objets très minces.

 

Il y a également des objets qui ont de la polarisation rotatoire et/ou de la biréfringence.

 

Dans la nature les objets sont souvent un mélange des deux (des trois) à la fois, par exemple paroi cellulaire et contenu cellulaire.

 

En fond clair, on voit ce qui absorbe ou colore la lumière, donc les objets "d'amplitude". Dans l'exemple ci-dessus, on voit surtout les parois des cellules qui sont absorbantes. Pour voir les objets "de phase", on fait une utilisation intensive de colorants, pour colorer les parois cellulaires (amplification du contraste), pour colorer sélectivement des éléments à l'intérieur de la cellule, etc. qui transforment les objets de phase en objets d'amplitude. On arrive par exemple à très bien colorer des noyaux de cellule, invisibles en fond clair sans coloration.

 

Le contraste de phase et le contraste interférentiel sont des techniques pour transformer des objets "de phase" en objets "d'amplitude". Passons sur la théorie. Dans l'exemple de Pierre et Pablito (DIC), on voit qu'en contraste interférentiel on voit le contenu des cellules (objets de phase) invisibles dans les autres techniques (sans coloration...). Ces techniques sont particulièrement intéressantes dans deux cas :

- on veut observer des cellules vivantes (nombreux exemples sur le forum), les colorants les tuant en général

- on n'a pas le temps, ou la flemme d'utiliser des colorations, qui peuvent être complexes à mettre en oeuvre (mais qui restent indispensables dans certains cas (anapath) car beaucoup plus sélectives)

 

L'observation en lumière polarisée, entre polariseurs croisés par exemple, donnera du fond noir si rien ne fait tourner le plan de polarisation mais on verra des objets ayant fait tourner le plan de polarisation, la lumière n'étant plus complètement bloquée par le deuxième polariseur (analyseur). Il y a des substances qui font tourner le plan de polarisation comme les sucres (carbone asymétrique). On fait des saccharimètres pour doser la concentration d'une solution de sucre en mesurant la rotation du plan de polarisation. Apparemment, les parois des cellules de cette mousse font tourner le plan de polarisation. Beaucoup de cristaux sont biréfringents et apparaitront en couleur entre polariseurs. La technique d'observation en lumière polarisée est utilisée en minéralogie, d'une manière quantitative, en rayons parallèles ou convergents, mais c'est assez complexe et il y a peu de minéralogistes sur ce forum. Sur l'image ci-dessus, on voit de nombreux points blancs qui doivent être des poussières minérales, faisant tourner le plan de polarisation.

 

Le fond noir utilise la propriété qu'ont tous les objets de diffracter de la lumière, en particulier sur les bords et là où il y a changement d'indice de réfraction. L'exemple ci-dessus met en évidence la diffraction par les parois cellulaires et plus de diffusion là où la feuille est plus épaisse. Le fond noir permet de voir des objets très petits mais n'apporte rien si ce n'est de la confusion sur des objets grands ou épais. On voit un certain nombre de points blancs sur l'image ci-dessus dus à de fines poussières qui diffractent bien la lumière.

 

Les techniques combinées apportent une combinaison des qualités et des défauts des méthodes utilisées. Dans l'exemple de la feuille ci-dessus, elles n'apportent aucune information supplémentaire aux techniques utilisées isolément.

 

Amicalement


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#5 Buteo

Buteo

    Invertébré

  • Membre confirmé
  • PipPipPip
  • 394 messages

Posté 14 février 2016 - 02:30

Sujet ...lumineux

Buteo


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