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Essai d'inclusions dans la glace

préparations - glace - inclus

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3 réponses à ce sujet

#1 JPL80

JPL80

    Nucléotide

  • Membre confirmé
  • 18 messages

Posté 11 septembre 2017 - 04:43

Bonjour

Je ne suis sans doute pas le seul microscopiste amateur à se désespérer d’obtenir des coupes suffisamment fines avec le classique microtome de Ranvier et le coupe chou, et ce malgré toute l’application que j’apporte à l’opération.

De plus, mon intérêt premier portant sur la botanique, je me heurte à une quasi impossibilité lorsqu’il s’agit de faire des coupes dans des tiges creuses ou des tissus mous.

 

Certes, il y a la solution du microtome de laboratoire type Minot et les inclusions dans la paraffine, le paraplast ou le PEG. Mais mon budget ne me permet pas de l’envisager.

 

J’ai donc essayé de faire des coupes après inclusion dans de la glace et je relate ici cette modeste expérience qui, je le dis d’entrée de jeu, me donne beaucoup de satisfactions.

 

1. Le matériel : l’investissement initial a été le suivant :

- un petit étau de bijoutier (12,99€ sur Internet), que je fixe sur un coin du bureau.

(nb. Très pratique, orientable, avec mâchoires de 50 mm protégées par du caoutchouc)

Etau1.jpg

 

- un bac à glaçons (moins d’un euro) :

(nb ; celui que j’utilise est bombé dans le fond de chaque alvéole, ce qui n’est pas pratique ; préférer des alvéoles à fond plat. Par contre, il vaut mieux que les parois des alvéoles soient légèrement obliques car cela facilite le démoulage).

Bac à glaçons1.JPG

 

- des plombs de pêche plats (1,80€ les 8) :

(nb. Avec un marteau et un clou ou une vis utilisée comme poinçon, j’ai fait 2 ou 3 creux dans chaque plomb ; ils serviront à maintenir en position les prélèvements de tige qui y seront enfoncés légèrement et coincés).

Plombs1.jpg

 

- quelques petits bacs en plastique récupérés ici ou là (jeux de construction d’enfants, etc.) (nb. Ils doivent être légèrement plus grands que les alvéoles du bac à glaçon), et punaises plates:

Bacs1.JPG Punaise1.jpg

 

- pour le reste, il s’agit du matériel que tout microscopiste possède : coupe chou, lames et lamelles…

 

2. La procédure pour les tiges :

 

2.1- l’échantillon de tige, de 3 cm environ, est enfoncé en position verticale dans un creux d’un plomb de pèche ou sur la pointe d’une punaise :

(nb. Si la tige est creuse, il faut d’abord la boucher sur quelques mm avec un petit morceau d’une autre tige pleine d’un diamètre approprié, de sorte qu’elle puisse rester dans la position verticale)

Fixation échantillons.JPG

 

2.2- puis placé dans un alvéole du bac à glaçon :

Echantillins dans bac.JPG

 

2.3- qui est alors rempli d’eau et placé dans le compartiment à glace du réfrigérateur.

(nb. Le plomb, la punaise, ou tout autre dispositif approprié, ne servent qu’à maintenir l’échantillon en position verticale et à l’empêcher de flotter à la surface).

 

2.4- Parallèlement,  un petit bac pas tout à fait rempli d’eau est également placé dans le compartiment à glace du réfrigérateur :

Bac support1.JPG

 

2.5- Après congélation, le glaçon contenant l’échantillon est démoulé, posé sur la glace du bac préparé en 2.4, collé avec quelques gouttes d’eau et remis dans le compartiment à glace du réfrigérateur pour consolidation :

Glaçon.jpg ------> Bloc prêt.jpg

 

2.6- Le bloc est alors placé dans l’étau et la surface est régularisée au cutter:

Planéification bloc.jpg

 

2.7- Utilisation du coupe chou pour les coupes :

Coupe au rasoir.jpg

 

2.8- Qui sont directement déposées sur la lamelle, dans une goutte d’eau :

Dépose coupe.jpg   Coupes.jpg

pour être ensuite préparées pour l'observation.

 

3. Procédure pour les tissus mous :

Le plus simple est de mettre un peu d’eau dans l’alvéole du bac à glaçon, de le mettre à congeler, de placer ensuite l’échantillon à la surface de la glace, et enfin de remplir l’alvéole en plusieurs fois, avec congélation à chaque fois, afin que l’échantillon soit emprisonné dans la glace et qu’il ne remonte pas en surface.

J’ai essayé avec des tissus animaux et cela fonctionne fort bien aussi.

 

4. Tissus fins types pétales, feuilles : les placer à plat dans l’alvéole, sur un fond de glace et recouvrir progressivement, avec congélation intermédiaire, comme ci-dessus.

Le glaçon sera ensuite collé sur sa tranche dans le petit bac présenté en 2.5.

 

En guise de conclusion (provisoire)

 

Ce procédé est très simple, peu coûteux, et il évite l’emploi de substances toxiques. Mais surtout, après quelques essais sur l'angle d'inclinaison de la lame du rasoir et la pression à exercer, il permet l’obtention de coupes fines réellement exploitables.

 

A la lumière ce cette modeste expérience et des quelques rares lectures sur le sujet que j’ai trouvées sur la toile, je donne quelques conseils :

 

- pour éviter la formation de cristaux qui endommagent les cellules, il est souhaitable que la congélation soit rapide (dans un congélateur plutôt que dans le compartiment à glace) ; l’utilisation d’un dispositif cryogénique comme ceux qui sont utilisés avec certains microtomes serait idéal, mais il a un coût.

Pour ma part, je me contente du compartiment à glace pour l’instant.

 

- la lame du rasoir coupe chou doit être très froide ; je la place donc quelques minutes dans le compartiment à glace avant de l’utiliser, et je l’y remets 5 mn après quelques coupes.

 

- de préférence il faudrait que la coupe se fasse en atmosphère froide (dans les cryostats de laboratoires cette température est maintenue à – 20°C), mais comme il n’est guère commode d’installer l’étau dans un congélateur, je fais l’impasse sur cette recommandation.

 

- dès que la surface du glaçon commence à fondre, il faut la replacer au froid quelques minutes. Cela se produit généralement après 6 à 10 coupes.

 

Les commentaires et nouvelles idées seront les bienvenus.

JPL80

 

 

 

 

 


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#2 Dominique.

Dominique.

    Invertébré

  • Membre AUTEUR
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  • 373 messages

Posté 11 septembre 2017 - 05:27

Bonsoir JLP 80

 

    Voilà   un  article  bien  commenté  et   bien illustré   sur une technique  peu courante mais   à  première vue  qui   apparaît intéressante.

 

    Reste  quand même  un point  délicat  - c’est celui de l’épaisseur  des coupes. ; sur la photo    tu   fais les coupes  à main   levée  - directement   sur le  bloc  , ce qui ne guide pas  ta lame    comme  peut  le faire le bord métallique  du Ranvier  ..

  Par ailleurs   j’ai  peur que la  congélation des  échantillons  ne les altère.

 

Ce qui m’ étonne  c’est cette difficulté que  tu rencontres avec le  Ranvier    ; Il  y a  plusieurs  modèle  dont  un qui ne  donne pas de bons résultats

http://www.naugraexp...for-biology-lab

 

Et un   qui en donne de très  bons

http://www.naugraexp...for-biology-lab

   en utilisant    du polystyrène (taillé   du diamètre du tube du  microtome avec  un emporte-pièce )  pour maintenir l’ échantillon . et  en utilisant  les  lames  à usage  unique  de type  schavette

https://www.amazon.f...e&condition=new

 

 

                      Amicalement

                                                                               Dominique


  • 0

#3 JPL80

JPL80

    Nucléotide

  • Membre confirmé
  • 18 messages

Posté 11 septembre 2017 - 08:16

Bonsoir Dominique

Merci pour ta réponse.

Je possède 2 microtomes de type Ranvier:

- l'un d'assez bonne fabrication, mais sans doute un peu fatigué; le filetage a des points durs, et il est dépourvu de mâchoires. L'avancée de l'échantillon (dans de la moelle de sureau ou du polystyrène) subit des à-coups, notamment à cause du frottement.

- j'en ai acheté un autre il y a quelques mois sur Internet, fabriqué apparemment en Espagne; il est équipé d'une seule mâchoire, et je pensais que cela irait mieux. Mais en réalité il est si mal fabriqué que c'est une honte de le commercialiser (pièces mal ajustées, filetage déplorable); je ne l'utilise plus.

 

En ce qui concerne les deux modèles que tu présentes:

- le premier est doté de 2 mâchoires; je croyais que c'était un plus car ce dispositif évite les frottements; cela ne suffit visiblement pas puisque tu écris qu'il ne donne pas de bons résultats.

- l'autre, que tu présentes comme meilleur, n'a pas de mâchoires. Est-ce que, malgré tout, le bloc polystyrène/échantillon coulisse et avance régulièrement dans le puits? Et l'avancement de 20 µm par division n'est-il pas important? Quelle épaisseur de coupe peut-on escompter en s'appliquant et en utilisant la schavette (que j'utilise déjà avec mon Ranvier)?.

 

Pour en revenir aux coupes dans la glace:

- en faisant quasiment "glisser" la lame sur la glace, sans chercher à l'enfoncer, j'obtiens assez souvent des coupes qui me semblent n'avoir que l'épaisseur d'une seule cellule; c'est facile, sans aucune résistance ni écrasement des tissus; je publierai des photos prochainement.

- sur les quelques végétaux que j'ai utilisés, il n'y a aucun endommagement par la congélation. Mais je ne suis pas sûr qu'il en serait ainsi pour tous les végétaux (on sait que le froid endommage certaines fleurs, feuilles etc.). Je n'ai pas encore essayé les champignons.

 

Bien à toi!

Jpl80


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#4 Dominique.

Dominique.

    Invertébré

  • Membre AUTEUR
  • PipPipPip
  • 373 messages

Posté 11 septembre 2017 - 09:08

Bonsoir

Il faut pour  cela  utiliser un polystyrène   très dense  - les plaques sont souvent bleues  ou  beiges  - et font souvent  2  à 3 cm  d’ épaisseur.

 

Tu tailles  ,avec l' emporte -pièce, un bloc  un peu supérieur  à la  taille  interne   de microtome  - tu  le fais  rouler à la main,  ce qui  le densifie   et  ensuite tu  le  moules  dans  le tube en ayant mis la visse  au plus bas  - il prend  parfaitement la  forme   du tube et glisse  avec une extrême douceur .

 

Une fois extrait du tube « le  rondin »  formé  tu le fends  à la lame de rasoir  et tu y places  , ton échantillon -  tu comprimes  le  tout en le replaçant dans le  tube du microtome.

Cela  donne  un certaine résistance   mais c’est grâce à cela  que  tu peux  monter  ton échantillon  de quelques  microns   en  tournant  ta visse au minimum  juste  pour que la lame du rasoir puisse accrocher  -( les coupes  arrivent  à  faire entre   10 et 20 microns ). Pour couper  il faut  ne pas penser  à l’ échantillon  mais  à  obtenir une lame  aussi parallèle à la table  du microtome que  possible .en prenant appui  sur cette table .

Après  un certain temps d’ entrainement  on arrive   à d’ excellents  résultats  ce qui  nécessite   somme  toute  très peu de manipulations .

 

  • Les Ranvier à mâchoire quel que soit le  fabriquant  sont fait pour être vendu seulement.
  • Certains arrivent  à s’en satisfaire- ce sont des manipulateurs d’exceptions.

Amicalement

                                                Dominique


Modifié par Dominique., 11 septembre 2017 - 09:14 .

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