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Coupes transversales fibres végétales


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16 réponses à ce sujet

#1 Julie-Thevenot

Julie-Thevenot

    Nucléotide

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  • 11 messages

Posté il y a 4 semaines

Bonjour à tous,

 

Après avoir passé une année à observer des vues longitudinales de fibres végétales sèches (coton,lin...) au microscope optique, je souhaiterais maintenant observer les sections transversales de ces fibres (sans coloration). 

 

Il y a pas mal d'informations sur ce forum concernant la préparation de coupes transversales de tissus biologiques mais les protocoles proposés ne me semblent pas adaptés pour l'observation des fibres.  

 

Pourriez-vous donc me préciser exactement le matériel dont j'ai besoin pour préparer des coupes transversales de fibres végétales (coton...) en me précisant les vendeurs éventuels ?

 

J'ai compris que mes échantillons devaient être préalablement enrobés dans une résine avant d'être tronçonnés. Dans mon cas, il ne s'agit pas d'histologie et il n'y a pas d'étapes de déshydratation à prévoir. 

 

Quels moules choisir ? (en métal ? dimension ?) 

Quelles cassettes utiliser ?

Quelle résine utiliser ?

 

Concernant le microtome...Cet appareil est t-il vraiment nécessaire dans mon cas sachant que les coupes seront observées en réflexion. Selon moi, les tranches n'ont donc pas besoin d'être ultra-fines mais je peux me tromper...

 

Quel instrument (pas cher < 300 euros) puis-je utiliser pour tronçonner mes échantillons simplement après les avoir enrobés ? Une simple lame de rasoir pourrait-elle suffire ?     

 

Merci pour vos réponses. 

 

Julie


  • 0

#2 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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  • 14 235 messages

Posté il y a 4 semaines

Bonjour Julie,

 

La technique de coupe n'est pas le plus gros problème. Mais cette technique dépendra quand même de ce que l'on veut observer et dans quel but.

Certes, si c'est pour observer en épiscopie, pour avoir une idée générale, une seule face suffit.

 

cotonnierok.jpg

Coton

 

Si c'est pour avoir une image bien résolue de la coupe, il faut observer  une coupe biface après imprégnation, en diascopie et en immersion.

 

L'enrobage ce n'est pas l'imprégnation !

Par exemple un enrobage ne pénétrera pas dans les lumen et la coupe, non soutenue par l'intérieur, se déformera.

 

Pour les moules, n'importe quel contenant fera l'affaire .

Un moule parfait peut être obtenu avec des pattes alimentaires cylindriques !

Il en existe de tous les diamètres. Notamment du diamètre d'un microtome à main.

Ensuite couler paraffine dans ces moules.

Il suffit de casser la nouille pour avoir un cylindre de la dimension voulue.

 

La coupe est alors traditionnelle.

 

Amicalement.


  • 0

#3 Julie-Thevenot

Julie-Thevenot

    Nucléotide

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  • 11 messages

Posté il y a 4 semaines

Bonjour Tryphon,

 

Je te remercie pour ta réponse rapide. 

 

Pour commencer, je souhaiterais juste observer la forme de la section (circulaire, en haricot, trilobé...).

 

- Pour le moule, je vais tester la méthode que tu proposes.

 

- Concernant la paraffine, as-tu une marque à me conseiller pour mon application ? J'ai en effet déjà travaillé avec de la paraffine mais je n'en ai pas un  très bon souvenir (la paraffine s'effrite quand on la triture un peu, elle durcit très vite...).

 

- Concernant le microtome, as-tu un modèle à me conseiller ? Il y a bien des microtomes à main vendus dans le commerce mais j'ai un peu peur que ceux-ci soient un peu fantaisistes...

 

Une lame de rasoir pourrait-elle suffire ?   

 

Julie


  • 0

#4 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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  • 14 235 messages

Posté il y a 4 semaines

R :

La paraffine est un peu affaire de spécialiste. Il en existe plusieurs d'ailleurs on parle de paraffines au pluriel.

L'utilisation dépend de plusieurs facteurs et la température ambiante compte beaucoup.

Dans les labos, il y a plusieurs références, mais on peut essayer sans se ruiner avec la paraffine pour confitures. Je m'en sers pour "lubrifier" les tables de ma machine à bois. 

 

I-Autre-18145_459x459-.net.jpg

 

Mais on peut essayer des tas de choses comme les colles type araldite, la cire à cacheter ( gomme laque et  térébenthine) , la cire de bougies, l'arcanson, la poix ...

En microscopie (et dans de nombreux domaines), tout est affaire d'imagination. 

Soit on utilise des techniques officielles et souvent onéreuses des labos  (c'est la "sécu" qui paye ou les ministères)  soit on cherche et on innove.

 

Il y a des microtomes à main sérieux et pas cher, mais l'essentiel est dans la lame !

 

Amicalement.


  • 0

#5 Dominique.

Dominique.

    Poisson

  • Membre AUTEUR
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  • 497 messages

Posté il y a 4 semaines

Bonsoir

 

Comme le dit tryphon le vrai secret est dans la lame  -

La meilleure à mon avis :

Feather professional Super 0;31 mm  20 blades

 

Pour le microtome   le plus simple , le plus ancien aussi   est le meilleur  toujours  selon  mes expériences.

http://www.naugraexport.com /hand-microtome-ranvier-for-biology-lab

ou

https://dir.indiamar.../microtome.html

le protocole  est   trés classique :

Technique de coupe

Avoir du polystyrène  expansé forte densité  (bleu   ou crème).

Avec   un emporte-pièce   découper   un  moule un peu plus  grand que le cylindre.

L’adapter  au cylindre  en le massant  et en le mettant en  place  en forçant un peu de façon à lui donner sa forme.

Le retirer.

Le fendre en 2.

Y placer l’échantillon.

Tourner la visse le plus faiblement possible  juste pour que le tranchant de la lame  puisse s y accrocher.

Faire une coupe à la lame de rasoir

 

Bon ! après  il y a une  technique  qui donne  des résultats aussi excellents .

C’ est  d’ avoir  un microtome de Minot  basique ( Radial  India en  vend  pour  des prix modiques mais   de modeste qualité   - suffisant pour un amateur )   et de  faire des  inclusions  dans le PEG 4000  ( commercialisé pour  traiter la constipation )   il fond à 46 °C  environ   et  respect  les  échantillons  .Mais  là on rentre  dans le plus compliqué  car  il faut  fabriquer un  moule  qui  s’ adapte au porte échantillons du microtome .

Quand  on coupe  avec un  Minot  des blocs de  PEG  il se forme  une poussière  granuleuse qui  fond immédiatement dans l’  eau  libérant  l’ échantillon .

Mais  le  microtome  est gradué  jusqu’ à 20µm ( les microtomes de laboratoires  vont jusqu’à  plus de 120µm  d’ épaisseur  - mais  on arrive  dans  le  franchement onéreux )   (  or en botanique  il faut des coupes  autour de 60 à 80 µm  ce qui est possible  en tournant  la roue  dentée  manuellement )

Les coupes  végétales  ne supportent   pas les coupes  fines , tout part  en charpie  ( en histologie animale  on  descend  à 7 µm  pas en  botanique   On peut  cependant  en réaliser  de merveilleuses   en utilisant  les résines  avec  cette épaisseur là  - mais là il faut  un ensemble de produits  chimiques  qui  sont de type professionnel  - le prix des  produits est aussi professionnel .

Donc possible mais  il faut du tempérament.

On peut   remplacer  le PEG 4000 par  de la  paraffine   mais des  coupes  à 60 µm s’ enroulent  il faut donc  leur faire  subir un  bain de Xylène  pour libérer la coupe -  c’est très faisable  -

 Amicalement

                  Dominique.


Modifié par Dominique., il y a une semaine.

  • 0

#6 Daniel Crabbé

Daniel Crabbé

    Procaryote

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  • 196 messages

Posté il y a 3 semaines

Bonjour Dominique,

 

Comment utilises-tu les lames Feather ?

Dans les rasoirs dédicacés je me demande si la largeur de lame qui dépasse est suffisante pour une coupe au Ranvier.

Cette réflexion me vient car dans la littérature on préconise une lame de rasoir plan concave (dans le cas du coupe-choux).

 

Cordialement.

 

Daniel


  • 0

#7 Dominique.

Dominique.

    Poisson

  • Membre AUTEUR
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  • 497 messages

Posté il y a 3 semaines

                Bonjour Daniel

 

       Les lames  Lame Feather  - sont   un peu courte. mais elles donnent  d’excellents résultats.

      Tu la tiens  tout simplement   fermement  entre le  pouce  et l’index    et  tu glisses la  lame  en  ne quittant pas  le  plan  de la plaque  du  Ranvier .

       Tu ne peux  pas te couper  si ton  geste  est posé   -  évidement   ce n’est pas conseillé  aux maladroits   . Et c’est très supérieur  à  toutes les  autres  techniques. Pour faire  plus  fin il faut un Minot    où ce type de lame  donne  des  résultats aussi  bon que les lames hors de prix pour microtome professionnelle.

     Amicalement

                             Dominique


Modifié par Dominique., il y a 5 jours.

  • 0

#8 Daniel Crabbé

Daniel Crabbé

    Procaryote

  • Membre confirmé
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Posté il y a 3 semaines

Merci beaucoup Dominique pour ta réponse.

Je vais en commander pour essayer.

 

Amicalement.

 

Daniel


  • 0

#9 Julie-Thevenot

Julie-Thevenot

    Nucléotide

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Posté il y a 3 semaines

Bonsoir,

 

Je vous remercie à tous pour vos réponses très instructives. 

 

Pour réaliser les inclusions, je vais finalement utiliser une résine Epoxy.

 

Pourriez-vous me conseiller une résine Epoxy qui répondrait aux contraintes suivantes :

 

- Résine qui polymérise à température ambiante (je n'ai pas d'étuve pour travailler à plus haute température)

 

- Une fois que la résine a durci, je souhaiterais pourvoir la découper à la main à l'aide d'une lame de rasoir ou une lame diamantée.  

 

Merci !

 

 


  • 0

#10 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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  • 14 235 messages

Posté il y a 3 semaines

Bonjour Julie,

 

J'ai cité l' araldite un peu rapidement. L'essayer uniquement comme milieu de montage des lames pas pour les inclusions.

 

Cela ne me parait pas faisable.

La résine epoxy en tant que milieu d'inclusion est utilisée en microscopie électronique pour pratiquer des ultra-coupes (de l'ordre du centième de micron) à l'aide d'un ultra microtome.

Les couteaux sont en diamant.

 

Amicalement.


  • 0

#11 Dominique.

Dominique.

    Poisson

  • Membre AUTEUR
  • PipPipPipPip
  • 497 messages

Posté il y a 3 semaines

 Bonsoir Julie

 

   Tu trouveras  tous les renseignements utiles  ici:

   http://www.amfb.eu/P...resineepoxy.pdf

 

   Mais pourrais-tu m’ expliquer pourquoi les techniques simples  ne te satisfont pas  - et quelles contraintes  t´obligent  à utiliser une technique  très difficile pour un laboratoire  non spécialisé .

 

                Amicalement

                              Dominique


Modifié par Dominique., il y a 3 semaines.

  • 0

#12 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté il y a 3 semaines

Bonjour,

 

j'ai mis un complément sur les couteaux en diamant ici


  • 0

#13 Dominique.

Dominique.

    Poisson

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  • 497 messages

Posté il y a 3 semaines

Bonjour

 

 Merci Michel pour ce document sur l’ultra-microtome .

 

Tu réponds  à une  de mes interrogations   qui était : « comment  peut-on réaliser  des coupes de moins de 1 µm  d’épaisseur ? »

La capacité de l’homme à créer de telles machines  est merveilleuse. ++++++++

 

  Amicalement

                    Dominique .


  • 0

#14 Julie-Thevenot

Julie-Thevenot

    Nucléotide

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Posté il y a 5 jours

Bonsoir,

 

Merci encore pour vos réponses.

 

Pour réaliser mes inclusions, j'ai utilisé deux techniques :

 

1) Inclusion dans la paraffine (Paraplast)

2) Inclusion dans la résine d'inclusion Cléopâtre

 

Les fibres ont été enrobées dans un cube de 1 cm de côté (utilisation d'un moule en silicone).

 

- L'inclusion dans le paraplast n'a pas été concluante. En effet, je ne dispose pas de microtome ni d'instrument adapté pour réaliser des coupes franches. Les cubes obtenus après durcissement étant quasi-opaques, cela ne m'a pas permis d'observer les fibres au microscope.

 

- Les cubes obtenus avec la résine sont transparents ce qui m'a permis d'observer les fibres au microscope (en réflexion) à travers la résine. 

 

Cependant, pour améliorer encore la qualité des observations, je souhaiterais utiliser du papier abrasif afin d'enlever l'excédent de résine et mettre la section transversale de ma fibre à nu (le reste restant enrobé dans la résine). On observe ainsi directement la fibre sans passer dans la résine.  

 

Savez-vous si cette technique a déjà été utilisée et si elle a donné de bons résultats ? L'idée étant de poncer suffisamment (en utilisant du papier dont le grain est de plus en plus fin) pour mettre à nu la section transversale de la fibre. 

 

Julie 


  • 0

#15 Dominique.

Dominique.

    Poisson

  • Membre AUTEUR
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  • 497 messages

Posté il y a 5 jours

Bonsoir Julie

 

Ton procédé  n’est pas   utilisé  dans le monde  la biologie à ma connaissance ( c’est une technique   de minéralogie ).
Dés  le  grossissement  40  tu vas  probablement avoir  des  stries  en grand  nombre qui  ne vont pas te permettre la moindre observation .

 

Mais  tu continues  de m’ étonner  -  l’ obtention de coupe  en longitudinal  n’ est pas  difficile   à la main  avec un  simple microtome de Ranvier  -

Je te donne  ici un exemple  de coupe  faite à la main avec un Ranvier

coupe d'une tige  de roseau

roseau texte 8.jpg

 

roseau cuticule 1.jpg

 

coupe  d'une tige de lierre

lierre texte 9.jpg

 

Type de microtome

 

http://www.brunelmic...hmicrotome.html

 

 

 

 

 

 

Amicalement

                                                  Dominique


Modifié par Dominique., il y a 3 jours.

  • 0

#16 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté il y a 5 jours

Bonjour Julie,

Je pense comme Dominique, le procédé n'est pas classique.

Cependant tu dois pouvoir obtenir un polissage de la résine de très bonne qualité, mais en utilisant des moyens importants.

 

Pour la methode du papier abrasif, Pablito l'utilise déjà , mais quand il y est forcé : minéralogie, fossiles.

Cette methode a un lointain rapport avec celle du polissage du verre que je connais et que je recommande ; le problème est qu'il faut du matériel spécialisé et du temps.

Le principe est d'utiliser des abrasifs de plus en plus fins, mais selon un protocole qui n'a rien du hasard.

 

Amicalement.


  • 0

#17 Dudulle

Dudulle

    Nucléotide

  • Membre confirmé
  • 26 messages

Posté il y a 4 jours

Bonjour

 

Je connais mal le domaine des coupes, par contre je bidouille beaucoup avec les résines dans le domaine du moulage.

Je serais très étonné que tu parviennes à un résultat correct, car la fibre étant moins dure que la résine celle ci va se retrouver polluée par la poussière de l'abrasion. Par ailleurs il faut une certaine dureté pour avoir une face bien plane.


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