Aller au contenu


***** Bienvenue dans le forum MikrOscOpia ! *****
Photo

comptage de cellules et microscopie


  • Veuillez vous connecter pour répondre
5 réponses à ce sujet

#1 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

  • Co-Admin
  • 3 402 messages

Posté 31 juillet 2019 - 03:43

En profitant de ce temps de vacances pour tourner un peu autour de la microscopie, allons explorer un des aspects quantitatifs de celle ci.
La morphologie du sujet qui nous intéresse dans un premier temps doit être souvent complétée par des éléments mesurables. L’ indication d’une échelle sur l’image, pour estimer la taille des sujets est déjà une première étape.
Mais dans des applications précises de laboratoire, le dénombrement/comptage d’éléments représente un moyen de comparaison dans le temps de l’évolution d’une culture par exemple.
Un des premiers moyens fut la numération visuelle au moyen d’une lame quadrillée calibrée telle que la lame de Malassez en exemple ci dessous . Chacun des plus petits carrés mesure 50 microns de coté . Le volume entre lame et couvre objet est également connu (ici à 0,2 mm)ce qui donne une répartition en volume.

La photo montre un comptage de levures par exemple  soit 19 cellules / 100 microns carrés.
malass.jpg

Mais  cette méthode s’avère rapidement fastidieuse si l’on doit faire de nombreux comptages . Dans les années 55 est apparu le compteur Coulter, montage très astucieux dont le principe breveté (j’aime beaucoup ce type d’ association de l’électronique et de la biologie !) est présenté  ci dessous .
 
Une solution diluée de particules, par exemple des globules sanguins, est déposée dans le vase V. Le tube T percé d’un orifice calibré aspire la solution . Grâce à des électrodes placées dans le vase et dans le tube, un courant est établi à travers l’orifice, les particules traversant ce dernier lors de l’aspiration produisent une  augmentation de la résistance de l’orifice qui se traduit par une impulsion électrique proportionnelle au  volume de liquide déplacé par la particule . Un circuit électronique à double seuil (Discriminateur) sélectionne les particules correspondant à la taille recherchée et permet un comptage dans le volume de dilution précis. En plus du comptage le volume cellulaire (surface des impulsions) est aussi enregistré.

Comme il peut arriver que l’orifice se bouche, sur les premiers modèles un microscope à projection (on en revient bien à la microscopie !) permettait de voir l’orifice en temps réel ! Ici M est l’optique de projection et «I » l’ illuminateur.
La société Coultronics dépends aujourd’hui du groupe Beckman… pour en savoir plus :
https://www.beckman....ulter-principle
coult1.jpg

Ci dessous des éléments réels du système . Le tube en U à droite était rempli de mercure et produisait l’aspiration et le déclenchement du comptage lorsque le mercure passait entre les deux contacts. Détail de l’ orifice à droite , en bas image de l’orifice grossie 20 fois : il est de 50 µm pour ce tube et percé dans un rubis.

Ce principe est encore utilisé, car le réglage des seuils électroniques permets de l’adapter à des tailles de particules très diverses. Il existe ainsi plusieurs tailles d’orifice selon les applications.
IMGP40132.jpg

Plus proche de nous , l ‘ imagerie vidéo et des traitements d’images permettent des quantifications encore plus précises par exemple avec le logiciel (Gratuit !) ImageJ on peut très facilement pour un amateur obtenir des informations de taille, distribution…éliminer du comptage des particules non significatives etc.. Voir image ci dessous qui est un montage de divers écrans….Bien entendu il faut étalonner le logiciel avant toute mesure sur l’image fournie par le microscope.
IJGB.jpg

Si ces applications vous intéressent chercher des utilisations modernes de comptage/identification/tri de cellules avec les mots clés : cytomètres de flux, cytofluorometres etc ….qui utilisent des lasers comme sources lumineuses et un marquage des cellules par des fluorochromes.

 

Amitiés

JMC
 


  • 0

#2 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

  • Membre confirmé
  • PipPipPipPipPipPipPipPipPipPip
  • 14 462 messages

Posté 31 juillet 2019 - 04:52

Bonjour Jean Marie et tous,

 

Très intéressant !

Comme à mon habitude, j'aime bien prendre un peu de recul et critiquer l'évolution des méthodes , qu'on me pardonne, mais cela peut donner des idées.

Comme évoqué plus haut, les analyses de sang ne se font plus "à la main" mais avec des machines automatiques.

Donc plus de confection de frottis sanguins colorés au MGG dans nos laboratoires d'analyse médicale et plus besoin non plus de microscopes !

Cela va beaucoup plus vite ET cela coûte bien moins cher !

Bientôt, il ne sera plus besoin d'enseigner cette discipline. Tout comme il n'est plus besoin de savoir faire une glycémie à la main avec une casserole sur un réchaud.

Mais ne risque-t'on pas de devenir trop dépendants de la technologie ?

La cytométrie de flux est programmé pour compter des cellules qu'on s'attend à voir dans le sang.

En règle générale les cytomètres de flux de nos LAM sont programmés pour compter 5 populations de globules blancs. (Neutrophiles, basophiles, éosinophiles, lymphocytes et monocytes). Que se passe-t'il quand des cellules de la moelle (blastes) passent dans le sang ?

Une laborantine entraînée les verra sur un frottis, mais la machine (CF) lambda ?

 

Amicalement.


  • 0

#3 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

  • Co-Admin
  • 3 402 messages

Posté 31 juillet 2019 - 05:36

Bonjour
Pour répondre en partie au sujet des populations cellulaires anormales, les cytomètres donnent aussi les résultats sous forme de graphiques multiparametriques et toute répartition anormale attire l'œil et....on fait alors une formule manuelle au microscope !

les cytomètres traitent 90/100 des formules normales.ce qui permet aux LAM de se concentrer sur les formules pathologiques.

Amitiés
JMC


Modifié par Jean Marie Cavanihac, 31 juillet 2019 - 05:44 .

  • 0

#4 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

  • Co-Admin
  • 3 402 messages

Posté 03 août 2019 - 08:50

Bonjour,

 

Le serveur Beckman était "down" depuis 3 jours, aujourd’hui cela refonctionne :  je remets le lien sur le principe du compteur Coulter :

 

https://www.beckman....ulter-principle

 

Amitiés,

JMC


  • 0

#5 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

  • Membre confirmé
  • PipPipPipPipPipPipPipPipPipPip
  • 14 462 messages

Posté 03 août 2019 - 09:50

les cytomètres donnent aussi les résultats sous forme de graphiques multiparametriques et toute répartition anormale attire l'œil et....on fait alors une formule manuelle au microscope !

 

Bonjour Jean Marie, tous,

 

Tu es bien optimiste (et bien sûr, il faut l'être)!

Cependant, une machine est faite pour donner un résultat recherché.

Le cytomètre de flux est assez polyvalent

En fonction des réglages  de la machine et des fluorochromes utilisés, on visera un résultat donné. 

Pour une NFS normale j'ai des doutes que l'on retrouve autre chose que ce que l'on cherche.

J'ai des doutes que l'on puisse détecter des plasmodium alors qu'une laborantine les verra en quelques secondes.

Mais comme je ne sais pas grand chose de la pratique des cytometres de flux, je me renseigne.

Quoi qu'il en soit, c'est une grande avancée du génie humain, mais il ne faut pas non plus que la technologie prenne le pas sur notre esprit critique.

 

Amicalement.


  • 0

#6 Jean Marie Cavanihac

Jean Marie Cavanihac

    AUTEUR-MODERATEUR

  • Co-Admin
  • 3 402 messages

Posté 03 août 2019 - 10:50

Bonjour
Tout a fait ! l'intérêt du cytometre est surtout le comptage. Par exemple les populations de lymphocytes T cd4 et cd8 dans le suivi d'efficacité de thérapies. En ce qui concerne l'identification d'un organisme pathogène la méthode manuelle reste indispensable... Mais des anomalies peuvent mettre sur la voie en voyant les répartitions taille/fluorescence des divers marqueurs utilisés. Comme toujours quand on ne sait pas ce qu'on cherche, l'observation optique permet d'orienter la stratégie...
Amitiés
JMC
  • 0




N'oubliez pas de consulter notre Magazine en ligne ... MIK-MAG!