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Séparation sur colonne de colorants commerciaux


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3 réponses à ce sujet

#1 Florent Bonnefoi

Florent Bonnefoi

    Invertébré

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  • 358 messages

Posté 17 septembre 2005 - 06:36

Bonjour,

Portant beaucoup d'intéret aux techniques chromatographiques pour l'immense variété de leurs applications, je m'intéresse de près au rapprochement de cette technique avec la microscopie.

En effet, de nombreux réactifs utilisés en chromatographie sur couche-mince (CCM, ou TLC) peuvent être détournés en colorations histologiques, quelque fois très sélectives, comme par exemple le réactif de Dragendroff, spécifique aux alcaloïdes (pour lequel je suis d'ailleurs toujours à la recherche de subnitrate de bismuth...).

Nombre de substances colorantes utilisées pour colorer nos préparations sont présentes sous forme de mixtures en solutions commerciales, par exemple dans les fongicides utilisés en aquariophilie
( Voir ICI)

Mais que faire lorsqu'il nous faut seulement l'un des colorants présents dans la mixture ?
C'est ici que la chromatographie intervient.

La chromatographie sur colonne plus exactement. Le principe ?
Globalement le même que la chromatographie sur papier ou sur couche-mince que certains d'entre nous ont pu effectuer en cours de chimie ou de bio :

Notre mélange de colorants est mis en solution dans un solvant et déposé dans une colonne maintenue verticalement, contenant un absorbant, généralement du gel de silice, de l'alumine ou encore du Kieselghur.

Un solvant (polaire ou non, selon le type de molécules à séparer), appelé phase mobile est introduit par la même extrêmité.
Cette phase mobile, afin de mériter son titre, va traverser peu à peu l'absorbant par capillarité, du moins généralement (nous, en pratique, pourquoi "généralement"), et "emporter" avec lui la mixture dans l'absorbant.

Cette mixture étant composée de molécules différentes, emportées par le solvant au travers de l'absorbant, elles le traverseront à des vitesses différentes.

De ce fait, les composés de cette "mixture" se verront séparés, et de plus en plus, au fur-et-à-mesure de leur progression dans la colonne.

A leur sortie, ils seront récupérés dans des tubes, changés à intervalles réguliers, afin de recueillir les colorants séparés.

Notons que plus la "hauteur" d'absorbant est importante, meilleure est la séparation.

Sachant celà, passons maintenant à la pratique...avec les moyens du bord.

Voici tout d'abord, le montage général de la colonne :

Miniature(s) jointe(s)

  • colonne_chromato_001_mikros.jpg

  • 0

#2 Florent Bonnefoi

Florent Bonnefoi

    Invertébré

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  • 358 messages

Posté 17 septembre 2005 - 06:55

La colonne est faite d'une pipette Pasteur en verre, donc le capillaire a été raccourci, et bien entendu, le filtre en coton enlevé...quoi que pas totalement :
un petit morceau de coton est conservé, roulé en boule, et introduit dans la colonne, jusqu'à l'étranglement.

Cette précaution évitera de récupérer la moitié de l'absorbant (poudre) dans le premier tube venu...

Ensuite, il est temps de songer au remplissage par l'absorbant.

L'absorbant ?
On a parlé d'alumine et de je ne sais quel truc teuton ?
Où tu veux que je trouve ça moi ?


A défaut d'absorbant "classique" on utilisera...du talc.
...Parait-il le charbon actif marche bien aussi.

On verse donc le talc dans la colonne (prévoir une coupelle dessous, seul environ 10% du talc versé arrive à destination ;) )
Mais pas trop ! Du fait de ,l'absorbant utilisé, on ne remplira la colonne que sur quelques centimètres, si vous voulez voir un jour du liquide en sortir par l'autre extrêmité !
On tassera un peu en tapotant la colonne ou bien à l'aide d'une tige.

Et ensuite ?
On fixe la colonne verticalement, on place un récipient dessous, et on songe au remplissage.

Normalement, un petit rond de papier filtre ou de coton peut-être utile poru éviter au talc de trop "remuer", mais on peut faire sans.

Prenons donc notre mixture en solution concentrée et versons-en quelques gouttes dans la colonne. Laissons un peu absorber, puis ajoutons le solvant...de l'eau, de l'éthanol, voire de l'acétone ou encore du chloroforme si la séparation nécessite un solvant apolaire.

Sur les photos, on voir le solvant et la mixture mélangés, c'est tout simplement du a une erreur de manipulation...
Celà dit, ça fonctionne quand même. :)

Il n'y a plus qu'à laisser migrer vers le bas et attendre...

...Attendre...Et ça peut durer de longues heures !

Et si je suis pressé ?

Eh bien...si l'on est pressé, il faut presser aussi.
Pour celà, on relie le haut de la colonne à une seringue de 50mL ou plus (observez la tête du pharmacien en lui demandant son plus gros modèle :D ) avec un tuyau en polystyrène ou mieux, en Tygon et on pousse sur la seringue...longtemps...

...Alors pour éviter les crampes, on la cale dans un étau, et on surveille de temps à autre tout en changeant à intervalles réguliers les récipients.

Miniature(s) jointe(s)

  • colonne_chromato_006_mikros_3.jpg

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#3 Florent Bonnefoi

Florent Bonnefoi

    Invertébré

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Posté 17 septembre 2005 - 06:59

Grace à cette pressurisation de la colonne, tout va aller plus vite, et au bout de quelques secondes/minutes, quelques gouttes d'une autre couleur se présentront à la sortie !


Reste à savoir si il s'agit bien du colorant recherché...et pour ça, il faut avoir un échantillon à comparer.

Miniature(s) jointe(s)

  • colonne_chromato_005_mikros_3.jpg

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#4 Florent Bonnefoi

Florent Bonnefoi

    Invertébré

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Posté 17 septembre 2005 - 07:04

Notez qu'une version "à aspiration" peut-être envisagée, il faut alors prévoir un récipient à l'intérieur de la seringue.

J'envisage un modèle double, sous pression à l'entrée et sous vide à la sortie, en utilisant un tube ou une fiole à vide en plus du système actuel, afin d'augmenter encore la vitesse de séparation et de pouvoir "rallonger" la colonne.


Terminons avec une dernière vue de l'absorbant en plein travail.

En espérant que cette petite démonstration inspirera... ;)

Miniature(s) jointe(s)

  • colonne_chromato_mikros_4.jpg

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