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FLuorescence primaire

FLuorescence primaire

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26 réponses à ce sujet

#1 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 19 juillet 2019 - 10:33

Bonjour,

 

J'ai en main un microscope à fluorescence et j'aimerais bien sûr faire quelques observations avec.

 

Savez-vous quels objets il est possible d'observer en fluorescence primaire ou auto fluorescence, c'est à dire sans produit fluorochrome ?

 

Quels objets simples (c'est à dire sans chercher à mettre en évidence des protéines... je n'en ai pas les compétences) peut-on observer avec des fluorochromes disponibles dans le commerce ?

 

Faut-il observer dans le noir ?

 

Les appareils photo et caméras numériques captent elles la lumière UV ? Et les argentiques ?

 

Merci

 


  • 0

#2 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 20 juillet 2019 - 06:51

Bonjour Didier,

 

Je m'excuse, je ne suis pas un as de la fluorescence, mais je peux donner certaines pistes.

 

D'abord ; ATTENTION aux microscopes à fluorescence !

Par définition, ils ont un éclairage qui émet des UV, c'est leur principe de fonctionnement.

Ces UV son bien gérés par le microscope grâce à des filtres bien conçus. 

Il n'y a donc aucun souci pour l'utilisateur averti avec un microscope bien entretenu.

Seulement, tout comme tout microscope d'occasion (= qui a servi et dont on ne connait pas la traçabilité), s'il s'agit un microscope qui ne sort pas de l'usine, ils ont été potentiellement mal traités...

Ne jamais les démonter soi-même.

Ne jamais regarder la lumière de l'éclairage , directement *Les UV, par définition, on ne les voit pas, on voit de la lumière riche en UV , mais pas les UV. Le danger est invisible.

 

Ceci dit, la chlorophylle correspond bien à la question posée.

Il a été assez souvent écrit dans le forum sur le sujet, particulièrement par Jean Marie Cavanhiac.

Rechercher dans Mikroscopia avec les mots clé Chlorophylle, fluorescence ....

 

Amicalement.


  • 0

#3 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 20 juillet 2019 - 08:40

Bonjour Tryphon,

 

Je suis au courant des précautions à prendre lors de l'utilisation de microscope à fluorescence, mais ce genre d'avertissement est toujours le bienvenu. 

Je vais  me documenté comme suggéré dans MikrOscOpia.

 

Amicalement


  • 0

#4 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Invertébré

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Posté 20 juillet 2019 - 11:27

Bonjour Didier,

 

il serait bon d´avoir un peu plus d´info de ton microscope. quelle source de lumière as tu? est-ce qu´il est epi ou dia-fluorescense. Quellques photos voudraient aider.

 

les sporanges des fougères sont souvent très attractif, algues avec chloropyll et naturellement tous les plantes vertes; du bois; la cellulose...ect.

 

Moi je fais beaucoup de la fluorescense pour recherches des defects en peinture des automobiles

 

800_IMG_0001.jpg

 

800_IMG_0001_17.jpg

 

K1024_Decoma 2007126.JPG

 
  • 0

#5 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 20 juillet 2019 - 03:32

Bonjour Klaus,

 

Le microscope est un Nikon labophot (belle mécanique très robuste soit dit en passant)..

La source lumineuse est une ampoule HG de 100 W.

 

Nikon Labophot 1024x768.JPG

 

Je dispose de trois filtres.

 

Filtres 2.JPG

 

J'ai déjà placé des morceaux de végétaux, mais sans grands résultats (seule la banane a réagi un peu). 

La lampe à mercure n'éclaire peut-être plus assez ?

Faut-il observer dans le noir ?

 

Pour la sécurité je pense qu'il faut que je m'équipe d'un filtre anti UV pour le placer entre moi et les objectifs ?

 

 

Amicalement.


  • 0

#6 jmaffert

jmaffert

    Hominidé

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Posté 20 juillet 2019 - 04:12

Bonjour, je ne comprends pas bien la dernière question : "Les appareils photo et caméras numériques captent elles la lumière UV ? Et les argentiques ?"

 

La réponse est oui, mais normalement ni l'oeil, ni un appareil photo ne doivent recevoir de la lumière UV dans un montage normal.

 

L'oeil ou l'appareil photo ne reçoit que du visible ré-émis par fluorescence sous excitation ultra-violet, violet ou bleu. Il y a quelque part un filtre coupe-UV.

 

Ou bien je n'ai pas compris la question ?

 

Il y a beaucoup d'objets qui sont fluorescents naturellement. Il faut essayer.

 

Cordialement


  • 0

#7 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 20 juillet 2019 - 04:46

Oui ma question n'était pas bien formulée.

Il s'agit de savoir si ce que l'on peut observer par fluorescence peut être rendu correctement par une caméra ou un appareil photo. 

Amicalement


  • 0

#8 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Invertébré

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Posté 20 juillet 2019 - 07:40

Il s'agit de savoir si ce que l'on peut observer par fluorescence peut être rendu correctement par une caméra ou un appareil photo. 

Amicalement

 

Bien sûr on peut Didier. Voir mes photos!

 

Ton filtre Nikon sera bien pour observer la fluorescense rouge du chlorophyll. Le Labophot est parfait. Est ce que tu as aussi une lampe pour la diascopie  Halogène 50 ou 100 W?


Modifié par Klaus Herrmann, 20 juillet 2019 - 07:48 .

  • 0

#9 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 20 juillet 2019 - 07:57

Oui Klaus, j'ai bien vu tes photos, celle des sporanges de fougères est sublime.

 

Le problème c'est que moi ça ne fonctionne pas. Je vois bien le faisceaux lumineux qui sort des objectifs et éclaire la préparation, mais rien de visible à la caméra.

 

J'ai aussi une lampe pour la diascopie (classique, sans fluorescence). Est-ce que je peux observer simultanément en diascopie classique et en épiscopie fluorescente ?


  • 0

#10 Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 20 juillet 2019 - 08:59

Bonjour Didier,

 

Je ne suis pas un spécialiste en fluorescence mais je peux te dire qu' en labo l' observation en fluorescence se fait dans une pièce noire l' oeil perçoit mieux les faibles lumières.

Concernant le fait que la caméra n' enregistre rien tu peux travailler en mode manuel, augmenter le temps de pause au maxi et/ou augmenter le gain.

cordialement,

JL


  • 0

#11 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Invertébré

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Posté 20 juillet 2019 - 09:31

Oui ma question n'était pas bien formulée.

Il s'agit de savoir si ce que l'on peut observer par fluorescence peut être rendu correctement par une caméra ou un appareil photo. 

Amicalement

 


Alors Didier,

 

mais rien de visible à la caméra.

 

 

mais est-ce que tu peux observer avec les yeux? On peut changer la voie de la lumière visible/photo avec un prisme changeable. Sur ma photo on peut voir un bouton noir au dessu du tournevis. Si on tire, cet prisme glisse en position "camera". Le microscope est un Olympus mais les fonctions sont égale.

Miniature(s) jointe(s)

  • K1024_IMG_0042.JPG

Modifié par Klaus Herrmann, 20 juillet 2019 - 09:34 .

  • 0

#12 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 20 juillet 2019 - 10:43

Enfin j'y suis arrivé.

 

Je ne voyais guère plus avec les yeux qu'avec la caméra, un léger halo bleuté.

 

En fait la lampe au mercure n'était pas bien positionnée, ce qui fait qu'il n'y avait pas assez de lumière qui arrivait sur la préparation.

 

Ma première observation et prise de vue avec fluorescence donc : un tige de clématite.

Tige de clématite coupe - Fluo (4) - 1024x768.jpg

 

Merci beaucoup

 

 

 

 

 


  • 0

#13 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 21 juillet 2019 - 07:56

Bonjour,

 

Mon petit grain de sel...

 

Les images en microscopie sont souvent peu colorées et sans beaucoup de contraste.

Le sang, qui est rouge à notre échelle macroscopique n'a plus sa couleur rouge au microscope.

Cela vient du fait que les objets ont peu d'épaisseur et présentent peu de pigments à la fois.

On en arrive à la conclusion que les parties colorées représentent l'amplitude de l'image .

Les objets non colorés ont , s'ils ont peu ou pas d'amplitude, ils ont quand même eux phase.

De part leur nature, ils déphasent la lumière, c'est à dire qu'ils apportent un retard sur l'onde lumineuse, plus ou moins grand.

C'est cette phase que l'on essaye de modifier pour augmenter le contraste de l'image.

Le contraste de phase le DIC, la fluorescence (et pour d'autres raisons, la polarisation)  sont des procédés qui agissent sur la phase de l'image.

La coloration, elle,  agit sur l'amplitude.

Les procédés contrasteurs de phase comme le Contraste de Phase ou le DIC agissent sur la phase des images et n'ont pas besoin de coloration, c'est ce qui en fait un avantage, ils permettent d'observer les objets sur le vivant, sans les tuer donc, comme ce serait le cas pour les objets colorés.

On n'observe donc pas avec les contrasteurs de phase, des objets artificiellement  colorés, sauf pour, éventuellement, des raisons artistiques.

 

La polarisation  est basée sur la propriété de certaines substances de modifier le plan de propagation des ondes.

 

La fluorescence, utilise la propriété de certaines substance  excitées par de la lumière , de réémettre de la lumière dans une autre longueur d'onde.

Cette fluorescence peut être naturelle comme pour la chlorophylle .

Mais elle peut être artificielle si on utilise des colorants spéciaux qui vont se fixer sur des structures bien ciblées de l'objet observé .

Par exemple :

On veut voir dans une cellule une molécule bien précise.

Cette molécule peut être considérée, biologiquement, comme un antigène .

Dans un premier temps on va "fabriquer" un anticorps  qui ne se fixera donc,  que sur cette molécule.

On va fixer sur cet anticorps un colorant fluorescent.

Dans la préparation, l'anticorps va cibler les molécules pour lesquelles il a été conçu et elles seules.

Au final, seules ces molécules seront visibles par fluorescence puisqu'elles sont maintenant liées au colorant.

 

Que ce soit pour la fluorescence naturelle ou artificielle, il est déconseillé d'utiliser des préparations déjà colorées.

 

Pour la clématite, je peux me tromper, mais il me semble que c'est une coupe déjà colorée, je ne crois pas qu'il y ait de la chlorophylle dans le xylème.

Pour voir la fluorescence naturelle, il serait mieux d'observer des feuilles de mousses ou bien des algues unicellulaires.

 

Amicalement.

 

 


  • 0

#14 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

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Posté 21 juillet 2019 - 09:40

Bonjour Didier,

 

merci pour ta photo. Je suis d´accord avec Tryphon que c´est une coupe déjà colorée. Et ce nest pas du autofluorescense. Pour voire que tous est ok avec ton équippement tu peux faire ce que Tryphon a dit: tu prends une feuille d´une mousse sur une lame; ajoute une goutte d´eau; couvert avec lamelle et puis tu prends filtre Nikon DM 510. La lampe HBO est déjà allumée il faut attendre quellques minutes avant  - puis la lampoule donne sa brillance parfaite. Il est bien conseillé de laisser la lampoule aux minimum 15 minutes allumée. Si on éteinds trop vite ça tue la lampoule.

 

Si tu ne peux pas observer une fluorecense rouge intensif comme sur ma photo il faudra chercher le défect. Il y-a trop de possibilitées - on ne peux pas faire per internet. Je pourrais faire,mais je pense que tu est situé trop loin de moi.

 

800_IMG_0001.jpg

 

800_IMG_0006.jpg


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#15 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 21 juillet 2019 - 06:12

Oui vous avez raison, j'ai pris une préparation que j'avais sous la main. Il vaut mieux ne pas prendre de préparation colorée. Je pense que c'est le colorant et non la chlorophyle qui a réagi.

Fond clair et fluo.JPG

 

Voici un brin d'herbe (on voit bien la chlorophyle en rouge), et des sporanges de fougère.

Brin herbe 1024x768.jpg

Sporange 1024x768.jpg

 

Merci pour le conseil à propos de la lampe.

 

Amicalement

 

 

 


  • 0

#16 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

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Posté 23 juillet 2019 - 09:27

Bonjour Didier,

bon de voir que c´était possible de te dépanner.

 

Ta première photo (fluorescense du chlorophyl) a un "hot spot" en bleu, ça veut dire que la lampoule HBO n´est pas dans la position correcte. Normalement il-y-a un focus pour la lampe. Sur ma photo c´est une HBO de ZEISS. La on a plusieurs possibilitées pour changer la position de la lampoule HBO et le bouton noir est pour regler le focus.

 

 

K1024_IMG_4106.JPG


  • 0

#17 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Invertébré

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Posté 23 juillet 2019 - 09:54

J´ai vu maintenant les deux photos de clématite. J´ai l´impression que tu a un filtre fluorescence inclus. Pour la diascopie l´équippement fluo  sera a côté. Ou ton condenseur n´est pas centré et en position correcte. Il manque de brillance, ça fait les couleurs faible.

 

800_IMG_0029.jpg


  • 0

#18 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 23 juillet 2019 - 10:44

Je découvre petit à petit le microscope et la fluorescence. 

 

J'ai mieux centré la lumière de fluorescence en me servant de l'objectif de centrage.

Nikon Labophot - Centrage de la lumière.JPG

Je ne sais pas à quoi servent les dispositifs de filtre ND2 ND4 à la sortie de la lampe HG.

 

J'ai toujours un léger halo bleuté.

Filtre DM510 - Halo bleuté au centre 1024x768.JPG

Je me demande si le filtre n'est pas un peu défectueux (je ne regarde que via la caméra dans le doute).

 

Les couleurs dépendent aussi du réglage du blanc de la caméra.

(L'éclairage de diascopie n'était pas très bien centré non plus).

 

J'ai pris un grain de sucre de canne qui m'a semblé émettre dans le vert.

Sucre - Nikon Fluo Obj10 (1) 1024x768.jpg

 

 Amicalement

 

 

 

 

 

 

Miniature(s) jointe(s)

  • Nikon Labophot - Centrage de la lumière 1024x768.JPG

Modifié par Didier Ba, 23 juillet 2019 - 11:00 .

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#19 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

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Posté 24 juillet 2019 - 08:52

Parfait Didier!

 

Si tu "joue" un peu avec bouton 4, peut-être le hot spot veut disparaitre. Est-ce-que tu as le hot spot avec les autres deux filtres Omega aussi?

Les filtres ND sont là pour diminuer l´intensité de la lampe.

 

Autre chose: fond claire en diascopie. Est-ce-que tu connais la méthode "köhler" pour optimer la position du condenseur? Si non je pourrais faire un scan d´une déscription en français.

 

Et - j´ai dit déjà - les filtres pour la fluorescense ne sont pas dans la voie de la lumière en diascopie.

 

J´ai eu le Labophot 2 quelques ans avant - très bon instrument!


  • 0

#20 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 24 juillet 2019 - 09:44

Bonjour Klaus,

 

Oui le labophot me semble être un bel instrument (dont je ne sais d'ailleurs pas encore tirer tout le profit).

 

Pour répondre à ta question, je n'ai pas de spot gênant avec les deux autres filtres Omega. C'est ce qui me fait penser que le filtre Nikon est peut-être un peu abîmé. D'autant plus que je parviens à bien centrer la lumière avec l'objectif de centrage.

 

Mais les filtres Omega ne réagissent pas à la chlorophylle, donc je me sers du filtre Nikon. Du coup par prudence je ne regarde pas à travers les objectifs lorsque je me sers du filtre Nikon. Je pense à en acheter un neuf.

 

Les filtres ND sont vides en fait (il n'y a que des trous). Là encore je vais en acheter, j'ai vu des filtre ND2 et ND4 en vente sur des sites de photographie. 

 

Je ne connais pas la méthode köhler. Je pensais qu'il s'agissait d'un condenseur particulier. J'ai regardé sur wikipédia, mais ça reste mystérieux pour moi.

 

Amicalement


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#21 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 25 juillet 2019 - 08:07

Bonjour Didier,

 

Je ne connais pas la méthode köhler. Je pensais qu'il s'agissait d'un condenseur particulier. J'ai regardé sur wikipédia, mais ça reste mystérieux pour moi.

 

Aïe ! ,

 

Mikroscopia est le forum de microscopie francophone par excellence !

L'éclairage de Kohler est l' éclairage de base de tout microscope qui se respecte.

Donc, on doit trouver cela dans Mikroscopia avant tout !

Et on le trouve! 

 

 

kolher.JPG

 Capture.JPG

 

 

 

Et puis on peut toujours demander aux spécialistes du forum ce qu'on n'a pas compris?

 

Amicalement.

 

Je signale que MicrOscOpies.com et le magazine Mik-Mag ( http://www.mik-mag.fr/) font partie intégrante de Mikroscopia.


  • 0

#22 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 25 juillet 2019 - 12:16

Bonjour Tryphon,

 

Merci pour ce document, (j'avais cherché par mot clef sur le site, mais la recherche par mot clef ne donne rien, pareil pour les mots autofluorescence et fluorescence).

Kholer.JPG

 

Via google ce document ressort dans les premiers, mais pas via Ecosia dont je me sers habituellement, (histoire de contribuer à planter des arbres). 

 

Je passe peut-être à côté de quelque chose, mais en lisant ce document (comme les autres), je ne vois pas ce qu'un condenseur Khöler à de plus par rapport aux condenseur que j'ai sur le Paralux L3000 et sur le Nikon Labophot. (Je veux dire que j'y retrouve les mêmes éléments). 

 

Pour le réglage :

- je mets d'abords la lumière au minimum (pour ne pas m'en prendre plein les yeux)

- je fais une première mise au point avec un objectif à faible grossissement

- je règle la hauteur du condenseur 

- je règle le centrage du condenseur

- je règle l'ouverture de l'iris du condenseur

- et enfin l'intensité de la lumière.

- (Après il y a encore le réglage du blanc sur la caméra)

 

Il y a peut-être un réglage que je ne fais pas bien. Je vais regarder ça de plus près.

 

Amicalement

 

 

 


  • 0

#23 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

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Posté 25 juillet 2019 - 01:21

Presque parfait Didier,

 

mais tu as oublie un point: l´iris du condenseur est ouvert et elle reste ouvert pendant l´operation.

 

Après ton deuxième point il faut fermer l´ìris dans le pied de ton  microscope ( on dit: diaphragme de champs  "DC"). Puis tu lève le condenseur jusq´au point où les lamelles du "DC" sont net. Maintenant tu peux centrer le condenseur et après tu ouvre le DC. Maintenant tous est parfait. Nota bene: l´intensité de la lumière est seulement règlé avec le potentiomètre - jamais avec le diapragnme du condenseur. Avec le diaphragme du condenseur on règle le contraste.


Modifié par Klaus Herrmann, 25 juillet 2019 - 01:22 .

  • 0

#24 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 25 juillet 2019 - 01:39

Merci, je vais essayer. Je vous tiens au courant.


  • 0

#25 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 25 juillet 2019 - 05:10

Je passe peut-être à côté de quelque chose, mais en lisant ce document (comme les autres), je ne vois pas ce qu'un condenseur Khöler à de plus par rapport aux condenseur que j'ai sur le Paralux L3000 et sur le Nikon Labophot. (Je veux dire que j'y retrouve les mêmes éléments)

 

Un condenseur de Kohler, çà n'existe pas !!!!

C'est le mode d'éclairage qui est selon Kohler 

 

Un microscope moderne est en principe équipé pour réaliser l' éclairage de kohler : une source lumineuse utilisée en collimateur , un condenseur de Abbe réglable en hauteur et deux diaphragmes, un de champ et un d'ouverture.

 

La première chose à connaitre pour utiliser rationnellement un microscope moderne est le réglage de l' éclairage selon Kohler.

 

Amicalement.


  • 0

#26 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

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Posté 25 juillet 2019 - 07:13

C´est facil de faire si on a comprit la méthode. Tu as fait des éfforts et je suis sûr que tu va apprendre aussi le rest.

 

Une autre chose: tu n´as pas besoin des filtres ND. Je connais beaucoup de microscopes avec équippement fluorescense, J´ai jamais vu des filtres pour diminuer la brillance  d´une HBO.

 

Le filtre Nikon est bon pour observer la flourescense rouge du chlorophyl. Mais les autres sont peut être bon pour observer la fluorescense d´une mouchoir papier (chez nous "Tempo")

 

https://www.google.c...mpo taschentuch


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#27 Didier Ba

Didier Ba

    Acide nucléique

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Posté 25 juillet 2019 - 07:52

Merci Klaus. Je vais essayer la fluorescence sur les mouchoirs jetables (je n'y aurais pas pensé) et du coup sur d'autres papiers. 

 

Pour les filtres ND, je vais laisser tomber pour le moment, d'autant plus que je peux jouer sur la luminosité au niveau de la caméra.

 

Amicalement


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