Bonjour,
Je sais que la microscopie en fluorescence n’est pas la technique de prédilection des membres de ce forum ; Il y a au moins deux raisons à cela : l’équipement et la préparation des échantillons.
Par contre, j’ai vu et lu qu’elle était parfois même déconsidérée car elle consistait plus à détecter de la lumière qu’à appliquer les lois classiques de l’optique pour former des images.
Pourtant une chose est certaine : dans les 40 dernières années, c’est la fluorescence qui a fait évoluer la microscopie, et les grandes avancées de la biologie sont dues à la microscopie en fluorescence.
Aujourd’hui, tous les labos de recherche l’utilisent, et elle représente un très fort pourcentage des investissements dans le marché de la microscopie.
Grâce à elle, nous sommes passés de la microscopie « descriptive » à la microscopie « fonctionnelle » et même à la microscopie « fonctionnelle du vivant ».
Je vous propose de vous raconter l’histoire de cette évolution, en essayant de rester compréhensible, et en évitant les formules complexes.
- Les origines
Des phénomènes de luminescence avaient été observés depuis très longtemps. Ainsi au XVIIème siècle Kircher avait parlé de luminescence du bois et avait proposé d’éclairer des maisons avec des lucioles.( !)
En 1833 Brewster parle de l’émission rouge de la chlorophylle.
En 1845 Herschel décrit la luminescence de la quinine en solution. Tout le monde peut faire cette observation aujourd’hui en observant, dans une pièce obscure du Schweppes (pas de pub) que l’on éclaire avec une lampe UV.(lampe halogène + filtre)
Stokes travaillera sur ces questions, traitera de la luminescence du fluorure de calcium, reprendra les expériences de Herschel et abordera l’aspect un peu plus théorique du phénomène d’excitation-émission.
Il faudra attendre la mécanique quantique et les travaux de Perrin et Jablonski pour expliquer les phénomènes de luminescence, que ce soit fluorescence ou phosphorescence.
Mais pendant ce temps, les microscopistes travaillaient…
Abbe avait en 1872-73 publié le principe de formation de l’image dans le microscope et donné avec sa célèbre formule, la limite de résolution d’un système optique
Formule gravée sur le monument de Abbe à Jena.
Il se trouve qu’en 1903, Auguste Kohler, qui travaillait lui aussi dans l’entreprise Zeiss dirigée alors par Abbe, (Carl Zeiss est mort en 1888), et en tant que Directeur de Recherches, faisait des tests pour valider la théorie de Abbe selon laquelle la résolution est directement à la longueur d’onde de la lumière.
Pour ce faire il utilisa un montage dans lequel il changeait de source pour travailler à plusieurs longueurs d’onde, et faisait des photographies du même objet. Dans tous les cas, avec la source UV, il ne pouvait pas observer directement pour raison de sécurité et parce qu’il n’aurait rien vu..
Kohler et son Microscope "test"
C’est alors qu’il vit sur ses photos faites en UV une lumière parasite qu’il interpréta comme une émission de lumière induite due à une excitation dont les UV étaient responsables. C’était la première observation d’une auto-fluorescence en microscopie.
Sur le moment, il ne savait pas à quoi cela pourrait servir, mais eut l’intuition qu’il y aurait un jour un intérêt.
En 1908 le premier prototype de microscope à fluorescence est construit par Kohler et Siedentopf.
En 1911 les premiers microscopes à fluorescence industriels sont construits par les sociétés Lehmann, Reichert et Zeiss. La même année, le chimiste Max Haitinger introduit la notion de fluorochrome, molécule qui a des propriétés de fluorescences et qui fixée à certaines organismes va les rendre visibles.
En 1914 on note la première utilisation de fluorochromes en tant que marqueurs en biologie cellulaire, par Stanislav von Provazek.
Au début des années 1920, il y a le développement de la microscopie en fluorescence avec les premiers marquages vitaux pour bactéries et protozoaires.
On peut dire qu’à partir de cette époque on va rentrer dans une deuxième phase de la microscopie en fluorescence.
Si cela vous intéresse, je vous raconterai l’histoire, sinon, je n’encombrerai pas d’avantage le forum .
Cordialement
