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FLUO

La microscopie en fluorescence II

FLUO

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5 réponses à ce sujet

#1 JML

JML

    Acide nucléique

  • Membre confirmé
  • 66 messages

Posté 01 février 2020 - 05:16

II.  50 ans de développement … avant la révolution

 

Nous en sommes restés au moment où la microscopie était en pleine expansion, la production devenait industrielle et les grandes sociétés étaient déjà présentes. Il est important de le dire car à cette époque, la majeure partie de l’innovation venaient des industriels, contrairement à aujourd’hui où ce sont les grandes universités ou centres de recherche qui ont souvent « les idées » et qui collaborent avec les industriels.

 

Nachet était créé en France en 1839,    Nachet.jpg

Zeiss en Allemagne en 1846,    Zeiss.jpg

Leitz également en Allemagne en 1849,   Leitz.jpg

Bausch et Lomb aux Etats Unis en 1853,   Baush et Lomb.jpg

Reichert en Autriche en 1876,   Reichert.jpg

Nikon au Japon en 1917,   Nikon.jpg

Olympus également au Japon en 1919,   Olympus.jpg

Et Wild en Suisse en 1921.   Wild.jpg

 

Revenons maintenant au sujet qui nous intéresse et dont certaines de ces sociétés seront des acteurs majeurs.

Le premier prototype de microscope à fluorescence fut présenté en 1929 par Philipp Ellinger et August Hirt. Ils firent des images de rein et de foie de rongeur après injection de fluoresceine et trypaflavine.premier proto.jpg

 

A partir des années 30, nous rentrons dans la phase de compréhension du phénomène et de développement technologique qui va durer une bonne cinquantaine d’année.

Depuis le début du siècle, grâce aux travaux de Planck, Einstein et Lewis, on sait que l’énergie d’un photon est inversement proportionnel à sa longueur d’onde E=hc/l, h étant la constante de Planck,  c la vitesse de la lumière, et l la longueur d’onde du photon.

On sait également, c’est la mécanique quantique, que les différents états d’énergie de la matière sont discrets et ne forment pas un continuum.

Toutes ces notions vont permettre à Jablonski et Perrin de synthétiser le processus de fluorescence dans un diagramme célèbre, connu sous le nom de son auteur.

Jablon.jpg

Voici un diagramme de Jablonski simplifié.

La molécule (le fluorochrome), au repos, est dans son état de plus bas niveau d’énergie ; Si on l’excite en lui envoyant un photon dont l’énergie est suffisante pour assurer une transition de l’état fondamental au premier niveau d’énergie excité, la molécule va absorber ce photon et se retrouver dans cet état, instable, et pour un certain temps, de l’ordre de quelques nano secondes.

Dans cet état excité, la molécule va perdre un peu d’énergie par dissipation interne, mouvements de translation, rotation, et aller au plus bas niveau d’énergie de cet état excité.

Et de là, elle va revenir au niveau fondamental en libérant de l’énergie, de façon radiative, c’est-à-dire en émettant de la lumière. C’est la fluorescence.

On voit sur ce diagramme que l’énergie libérée et plus faible que l’énergie absorbée. Cela se traduit par le fait que l’émission de fluorescence se fera à des longueurs d’onde supérieures à l’excitation.

Par exemple, on excite dans le bleu et on observe dans le vert, ou on excite dans le vert et on observe dans le rouge.

La différence entre la longueur d’onde d’excitation et celle d’émission s’appelle l’écart de Stokes.

En réalité on parle de longueur d’onde, mais il ne s’agit pas de raies d’émission comme pour les atomes, mais de spectres plus ou moins larges, la longueur d’onde dont on parle correspondant au maximum de l’émission.

 

C’était peut-être un peu fastidieux de décrire le processus de fluorescence en détail comme ceci, mais c’est pour bien comprendre dans les chapitres suivants les difficultés et l’intérêt de certaines propriétés et caractéristiques.

 

Dans ces années 30, la physique est en pleine effervescence, et il faut parler d’une personne qui n’est pas connue du grand public, et qui pourtant a fait une remarquable carrière et découvert entre autre  une chose qui aura des conséquences sur le développement de la microscopie à  fluorescence.

 Il s’agit de Maria Goeppert-Mayer.   Coeppert.jpg

Elle était étudiante dans le laboratoire de Max Born (prix Nobel de physique 1954) à Göttingen, et travaillait sur les interactions entre photons et matière. Sa découverte et la suivante : elle prédit que l’énergie apportée par deux photons de grande longueur d’onde (rouge) est équivalente à l’énergie apportée par un photon bleu. Ces deux photons rouges peuvent donc exciter un fluorochrome qui émettra une fluorescence équivalente à celle obtenue par une lumière excitatrice de courte longueur d’onde.

De sa vie elle n’aura pas l’occasion de vérifier expérimentalement ce principe appliqué à la microscopie, elle décède en 1972 après avoir obtenu le Nobel de physique en  1963.  On lui doit, ce qu’on verra plus loin et qui représente un intérêt majeur dans le développement de la microscopie à fluorescence, la microscopie bi (multi) photonique.

 

A la même époque, un physicien hollandais qui travaillait sur la diffraction des réseaux, voit sous un certain angle, une image surprenante. Il analyse le phénomène observé, et a une idée géniale, c'est d'adapter à un microscope les éléments qui lui ont permis de voir cette image étrange.

Le physicien était Frits Zernike, et il venait d'inventer le contraste de phase

Zernike.jpg      1er micro cte phase.jpg

En 1936, il construisit le premier microscope à contraste de phase, et obtint le prix Nobel de Physique en 1953.

Grâce à lui, il devenait évident que la microscopie pouvait s’intéresser au vivant invisible, et que contraste de phase et fluorescence seraient deux techniques importantes dans ce cadre.

 

Les microscopes à fluorescence à cette époque fonctionnent sur le principe du microscope à fond noir développé par Zsigmondy en 1903 pour observer des particules d’or colloïdal. On illumine donc en transmission, via un ultra condenseur à fond noir ; On excite ainsi sous incidence rasante. L’émission de fluo étant tous azimuts, on va l’observer classiquement à travers un objectif compatible en terme d’ouverture avec la technique de fond noir. On placera des filtres d’arrêt dans le trajet optique ou sur les oculaires pour couper toute la lumière excitatrice qui a traversé, et ne laisser passer que la fluorescence.

La manipulation n’est pas très simple ni ergonomique, mais cela marche pas mal et cette configuration sera utilisée jusque à la fin des années 60.

Les sources d’excitation vont évoluer et on va passer de la lampe Cadmium, à la lampe à arc de carbone, à à la lampe à vapeur de mercure à basse puis à haute pression. On verra dans les « temps modernes » l’apport des LED et des lasers.

La biologie avance parallèlement et dans les années 40-50,  Coons développe le marquage d’anticorps  avec des molécules fluorescentes pour localiser des antigènes. coons.jpg

Puis il va utiliser cette reconnaissance antigène-anticorps marqués à des fins de diagnostique pour identifier des microorganismes pathogènes. C’est le début d’une période importante qui verra l’immunofluorescence remporter les challenges suivants grâce au couplage de fluorochromes sur les anticorps:

  • Ne pas perturber la liaison avec un antigène
  • Fluorochromes excitables dans le visible et donc minimiser l’autofluorescence des tissus sous excitation UV
  • Bon rendement et sensibilité de la méthode
  • Spécificité de la méthode.

La fluorescence va s’imposer comme technique de microscopie tant dans les labos de recherche que dans la biologie médicale. (maladies infectieuses, toxoplasmose, ….).

 

La dernière avancée dont je parle aujourd’hui dans cette période de l’histoire intervient en 1952 avec l’invention du miroir dichroïque par deux scientifiques soviétiques Brumberg et Krylola. Le miroir dichroïque (beam splitter en anglais) est une lame de verre recouverte d’un dépôt particulier, et qui a la propriété de se comporter différemment avec la lumière en fonction de la longueur d’onde.

Ainsi si on place un miroir de ce type à 45° dans un faisceau,  la lumière dont la longueur d’onde est inférieure à une longueur d’onde critique (500 nm par ex) sera réfléchie à 90°, et la lumière dont la longueur d’onde est supérieur traversera tout droit.

 

La configuration du microscope à fluorescence va alors changer. En 1967, Ploem décrit l’illumination incidente ou épi-illumination, et il établit une collaboration avec Schott pour la fabrication des filtres et Leitz pour intégrer ce trajet optique dans un microscope.

trajet.jpg

Le microscope à épi-fluorescence devient universel et tous les microscopistes adopteront son principe.

On rentre dans l’ère moderne.

 

A bientôt pour la suite

 

Cordialement

 

 


  • 0

#2 Jean-Marc Babalian

Jean-Marc Babalian

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 01 février 2020 - 07:56

Bravoooooo !
Et merci
JM
  • 0

#3 sciroccoblow

sciroccoblow

    Eucaryote

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Posté 02 février 2020 - 10:46

Bravo,

 

c'est un très bel article  B)


  • 0

#4 scrophulaire

scrophulaire

    Eucaryote

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Posté 02 février 2020 - 11:33

merci pour cet exposé


  • 0

#5 jmaffert

jmaffert

    Hominidé

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Posté 02 février 2020 - 03:04

Bonjour, bel exposé, bien illustré.

 

Deux petites remarques : diagnostic s'écrit ainsi. En anglais beamsplitter n'est pas synonyme de miroir dichroique, cela couvre également les miroirs partiellement réfléchissants.

 

Cordialement


  • 0

#6 jmaffert

jmaffert

    Hominidé

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Posté 03 février 2020 - 09:27

Les miroirs dichroïques sont fabriqués par un empilement de couches minces d'indices différents, comme les filtres interférentiels.

 

Cordialement


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