Les colorants en microscopie botanique.
Pour les débutants.
( Il existe déjà de nombreux articles sur le sujet .mais chacun a sa manière de le présenter .)
Une question revient sur le site au sujet des colorants - Les nouveaux acteurs en microscopie se demandent parfois qu’elles sont les produits intéressants.
Pour débuter il faut reconnaître que les colorants ne sont pas nécessaires , en particulier en Protistologie ; mais il faut aussi reconnaître que leur utilisation est une source de joie à la vue des résultats qu’ils procurent en Botanique .
Le but de ce court article est de présenter les colorants les plus intéressants - ( c’est-à-dire que l’on peut trouver sur le marché sans difficulté ) - leur protocole de mise en œuvre et le résultat possible ( bien que vous pourrez obtenir de bien meilleurs résultats que ceux que je vous expose ) .
Dans cette présentation je reprends certains protocoles qui nous ont été offerts par les membres de MikrOscOpia .
Pour ceux qui ont lu des livres anciens comme le Langeron ; le Locquin et le Seguy les colorations apparaissent très complexes. Ces protocoles ne sont pas utilisables par les amateurs. Les produits nécessaires ne sont disponibles que pour des laboratoires spécialisés ayant un volume d’ utilisation sans mesure avec nos besoins .
Pour illustrer mon propos j’ai fait une coupe de la tige de l’année de la Prêle , des ovaires de la fleur de tulipe et des tiges de l’ année de Millepertuis .-
NB -( la coloration des champignons n’est pas incluse dans les protocoles présentés )
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Precautions préalables :
* toujours travailler dans des verres de montre.
* faire des coupes le plus mince possible avec un microtome manuel de Ranvier
* Étape 1 Bain dans Dakin si on désire découvrir le squelette de la cellule dans les formes de sa structure pendant 5/ 10 minutes.
Si on désire regarder les organites intra cytoplasmiques ne pas utiliser ce produit.
Bien rincer avec 3 bains d’eau déminéralisée.
*Étape 2 Pour améliorer la qualité de la coloration faire un bain de l’échantillon : 2 possibilités :
*Vinaigre – le vinaigre a un taux d’acide acétique entre 3 et 8 % (on peut l’utiliser en le diluant dans un même volume d’eau) ou utiliser acide acétique à 2 % - 4 minutes
*AFA (Alcool 95 dénaturé 80ml + formol 40% (celui du commerce) 15cc +acide acétique glacial (c’est son nom) 5 ml ) pendant 8 minutes.
*Etape 3 la coloration
D’emblée sont exclus les colorants alimentaires - les résultats sont d’une grand pâleur et vraiment sans intérêt - de plus leur prix est supérieur à un flacon de carmin , de safranine ,ou de bleu de méthylène par exemple .
Quand on veut colorer il faut savoir effacer. Cela est vrai en dessin comme en botanique .Il y a l’équivalent d’une gomme qui régule une coloration un peu épaisse, un peu excessive : c’est l’alcool chlorhydrique
Très facile à réaliser (on trouve les deux produits au rayon droguerie)
: Alcool 95 dénaturé: 10 cc + Acide chlorhydrique de ménage : 1 cc. (ou 10 gouttes de l’ un pour une goutte de l’autre)
Bien surveiller car très efficace - Rincer à l’eau quand la couleur de la préparation vous satisfait.
La coloration a pour but de mieux distinguer les parties constituant l’échantillon que l’on examine .Il y a plusieurs possibilités
--on réalise une coloration monochrome - c’est le plus facile avec les anciens colorants .
--on réalise une coloration avec deux produits différents qui vont agir différemment en fonction de la constitution de l’échantillon - ce qui veut dire que toutes les associations ne donnent pas forcement de résultats correctes - Pour cela plusieurs étapes sont possibles .
(on réalise parfois une coloration complexe faisant intervenir 3 à 4 produits .)
Les exemples :
(Les photos sont des panoramiques de 25 images)
Coloration : Giemsa rapide ( Azur +Bleu de méthyléne + Eosine). ( il existe une forme lente du produit . Cela ne doit pas changer grand-chose en botanique ( ce colorant est celui utilisé pour colorer les globules blancs ) .
A noter le caractère bien coloré des noyaux cellulaires .
Mise en œuvre :
Étape 3
Bien rincer avec 3 bains d’eau déminéralisée.
Mettre sur les échantillons 3 gtt d’eau déminéralisée puis 2 gtt de Giemsa .
Attendre 4 minutes.
Bien rincer avec 3 bains d’eau déminéralisée.
Si la coloration est trop forte mettre 2 gtt d’alcool chlorhydrique.
Arrêter la réaction dès que la coloration est satisfaisante.
Bien rincer avec 3 bains d’eau déminéralisée.
Éosine aqueuse 2% 2 gtt sur l’échantillon - Laisser 1 minute.
Déshydrations alcool isopropylique 100.
Éponger le trop d’alcool sur la lame
Montage dans Euparal.
Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration avec l ' Etzold Bleu ( Basic violet / Chrysoidine /Bleu Astra ) .
Protocole de Klaus
Mise en œuvre :
Étape 3 :
- Rincer à l’eau déminéralisée 3 fois.
- Etzole Bleu – Laisser agir 4 minutes.
- Rincer à l’eau déminéralisée 3 fois.
- Si la coloration est trop forte
- Soit refaire la préparation en diluant le produit 1 gtt du produit + 1 gtt d’eau
- Soit Différencier si la surcoloration est très intense par mettre 2 gtt d’alcool chlorhydrique. (mais méfiance : tout se décolore très vite)
- Soit mettre dans l’ alcool isopropylique 70% (mais son action porte plus sur le rouge que sur le bleu.)
- Arrêter la réaction dès que la coloration est satisfaisante.
- Déshydration alcool isopropylique 100.
- Éponger le trop d’alcool sur la lame
- Montage dans Euparal.
- Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration avec Acridinerote /Acrifalvine puis bleu Alcian . Protocole de Klaus
Étape 3 :
Rincer à l’eau déminéralisée 3 fois .
Acriflavin/acridinrot - couvrir l’ échantillon – Laisser agir 2 minutes .
Rincer à l’eau déminéralisée 3 fois .
Bleu Alcian - laisser agir 2 minutes .
Rincer à l’eau déminéralisée 3 fois.
Différencier dans Alcool isopropylique 70 (surveiller le résultat) .
( Si la coloration est trop forte il est possible de diluer les produits utilisés : 1 gtt du produit + 1 gtt d’eau avant de faire la coloration ).
Déshydration alcool isopropylique 100.
Éponger le trop d’ alcool sur la lame.
Montage dans Euparal.
Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration avec le Bleu de Méthylène / Eosine.
Coloration double de Pésez.
Faire le mélange :
-- Alcool isopropylique à 99% 12 cc.
-- Solution aqueuse d’éosine à 2% (pharmacie) 1,5 cc.
-- Bleu de méthylène aqueux 2 % (pharmacie) 0,5 cc.
Pour les mesures prendre une seringue de 1 cc et de 10cc (pharmacie)
Cette préparation ne se conserve pas et doit être refaite avant chaque coloration.
Si on réutilise cette préparation le lendemain on obtient la coloration de l’échantillon de droite ci-dessus .
Étape 3
Couvrir l’échantillon de quelques gouttes du mélange environ 30 secondes à 1 minutes pas plus.
Rincer à l’eau déminéralisée.
Déshydration alcool isopropylique 100.
Éponger le trop d’alcool sur la lame
Montage dans Euparal.
Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration Safranine simple et safranine bleu astra :
Etape 3 :
- Rincer dans eau déminéralisée 3 fois.
- Safranine du commerce : diluer ( 3 gtt de safranine + 3 gtt d’ eau .déminéralisée ) dans le verre de montre sur l’ échantillon - Laisser agir 5 minutes .
- Si la coloration est trop forte différencier avec Alcool Chlorhydrique ( voir ci-dessus )
- Rincer 3 fois de suite
On peut si on le désire associer le bleu Astra
- Même protocole que précédemment avec la Safranine.
- Astra bleu 3 gtt - Laisser agir 20 secondes est un grand maximum.
- Déshydration alcool isopropylique 100.
- Éponger le trop d’alcool sur la lame.
- Montage dans Euparal.
-Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration vert de Mirande (Vert de méthyle + Carmin ).
Mise en œuvre
Etape 3
- Rincer 3 fois à l’ eau déminéralisée ;
- Couvrir l’échantillon avec 4 gtt du vert de Mirande.
- Laisser agir 10 minutes .
- Rincer 3 fois à l’ eau déminéralisée.
- Déshydration alcool isopropylique 100.
- Éponger le trop d’alcool sur la lame
- Montage dans Euparal.
- Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration Carmin aluné :
Étape 3
Bien rincer à l’eau déminéralisée 3 fois .
Dans un verre de montre mettre sur l’ échantillon quelques gouttes de carmin aluné . Laisser 30minutes à 1 heure .
Rincer l’eau déminéralisée 3 fois .
Déshydration alcool isopropylique 100.
Éponger le trop d’alcool sur la lame.
Montage dans Euparal.
Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration Carmin acétique + vert de méthyle .
Étape 3 :
Bien rincer à l’eau déminéralisée 3 fois.
Couvrir l’échantillon avec quelques gouttes de Carmin acétique – laisser agir 2 heures .
Préparer dans un verre de monte Eau 8 gtt + Vert de Méthyle 2gtt.
Retirer le Carmin et sans rincer couvrir l’échantillon avec la préparation - Laisser agir entre 15 et 30 secondes pas plus ++.
Retirer l’eau et dans le verre de montre couvrir l’échantillon avec le mélange
Eau 40 cc + 3 gtt de liquide vaisselle.
Chauffer au bain marie la gélatine glycérinée pour la rendre liquide
Mettre une goutte de gélatine sur une lame.
Vider l’eau du verre de montre et faire glisser l’échantillon dans la gélatine glycérinée - et en ajouter une goutte sur l’échantillon.
Couvrir avec une lamelle
Si la manipulation a été bien faite il n’y a pas de bulle d’air.
Laisser refroidir .
Le lendemain luter les bords de la lamelle avec une couche de vernis à ongles .
.
Carmin acétique + vert d’ iode
Je n’ ai pas trouvé de fournisseur présentant un vert d’ iode qui colore correctement - Celui vendu pour les cours SVT dans les collèges est trop dilué .
Coloration Violet de gentiane / Eosine .
(La coloration n’est pas très homogène mais ici ce n’est pas gênant pour la présentation)
Après fixation
Rincer 3 fois avec eau déminéralisée
Éosine aqueuse 2% 7 minutes
Rincer 3 fois
Violet de gentiane -il faut trouver la bonne dilution - ici j’ai dilué au ¼ 2 gouttes de violet pour 8 gouttes d’ eau déminéralisée 30 secondes ( au-delà le bleu écrase le tout – c’est d’ ailleurs le problème avec tous les bleus qui ont un pouvoir écrasant très important) .
-Si nécessaire différencier dans l’ alcool isopropylique 70 % puis 100 % - bien surveiller
.
Déshydratation avec alcool isopropylique 100 le temps de passer les échantillons sur la lame.
Éponger le trop d’alcool sur la lame .
Monter à l’ Euparal
. Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Coloration au Bismark .
Après fixation.
Rincer 3 fois avec eau déminéralisée.
Couvrir l’échantillon avec quelques gouttes de Bismark - laisser 10 minutes mais on peut laisser plus il n’y a pas de risque de surcoloration.
Déshydrater avec alcool isopropylique 100%.
Déshydratation avec alcool isopropylique 100 le temps de passer les échantillons sur la lame.
Éponger le trop d’alcool sur la lame.
Monter à l’ Euparal.
Mettre un poids sur la lamelle ( 3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.
Je vous ai présenté quelques solutions à ce problème de colorations pour ceux qui n’ en ont jamais réalisées –le sujet est important il sera à creuser tranquillement .
Au montage la difficulté avec les bulles d’air .
Pour éviter les bulles d’air qui sont toujours présentes , il existe des solutions imparfaites . Le fait de faire un bain dans un alcool Isopropylique 100, suivi d’un montage avec l’ Euparal ou du baume du canada , limite déjà le nombre de bulles car ces deux produits sont friands en oxygène - Une fois que vous avait mis le milieu de montage sur l’ échantillon , avant de placer la lamelle , tapoter un peu l’ échantillon avec une petite tige métallique .Cela fait fuir les bulles - Poser ensuite la lamelle - Placer sur la lamelle un poids de quelques grammes pendant ¼ d’heure. Les bulles disparaissent en 24 heures.
Autre technique mettre 1 à 3 gouttes de liquide vaisselle dans ½ verre d’ eau Faire tremper l’ échantillon et monter avec la gélatine glycérinée en procédant comme on vient de le voir.
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PS :(Pour la déshydratation dans les livres anciens vous rencontrez des protocoles avec des passages dans des alcools 30 - 60 - 90 où l’ inverse ; passer au 100 directement ne change rien à l’ affaire mais il n’est pas interdit de faire du progressif ou du dégressif .) L’ alcool isopropylique 70% enlève les couleurs . L’ alcool isoprpopylique 100 ne modifie rien .
https://forum.mikros...on/?hl=colorant
Liste des autres colorants utilisables :
la Phloxine B alcoolique (elle colore en mauve violet)
le Rouge Congo SDS en mycologie
le Rouge neutre (il colore en rose rouge)
la Fuchsine phéniquée de Ziehl, préparée à base de fuchsine basique (elle colore en bleu violet et peut être régressée avec de l’acide chlorhydrique à 5 %)
Rouge neutre - Colore les vacuoles
Orcéine acétique - Colore les chromosomes de racines des liliacées
Lugol - Colore les noyaux des cellules végétales et met en évidence les grains d'amidon
Ziehl Nielsen - Colore les membranes cutinisées.
Rouge de ruthénium - Colore les composés pectiques.
Soudan III - Colore en rouge les lipides
Référence :
Liste des colorants possibles
http://wwwpsvt.free....s.htm#colorants
PS : La grande difficulté est de trouver des fournisseurs qui acceptent de vendre aux particuliers des produits correctes - une liste de fournisseurs est disponible m’écrire : Forum – Cliquer sur la photo – Rubrique : écrire un message).
Dominique .
Modifié par Dominique., 21 avril 2020 - 10:04 .
