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Colorants Colorations végétales


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11 réponses à ce sujet

#1 Dominique.

Dominique.

    Purgatorius

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  • 785 messages

Posté 21 avril 2020 - 10:01

Les colorants  en microscopie  botanique.

Pour les   débutants.

 

( Il existe déjà de nombreux articles  sur le sujet .mais chacun a sa manière de le présenter .)

Une question revient sur le site au sujet des colorants  - Les  nouveaux acteurs  en microscopie  se demandent parfois  qu’elles  sont les produits intéressants.

Pour débuter  il  faut reconnaître que les colorants ne sont pas nécessaires , en particulier  en   Protistologie ;  mais  il faut aussi  reconnaître que leur  utilisation   est  une  source de joie   à la vue des résultats  qu’ils procurent  en Botanique .

Le but de ce court article   est de présenter  les colorants les plus  intéressants  -  ( c’est-à-dire  que l’on peut trouver sur le marché sans difficulté  )   - leur  protocole de mise en œuvre et le résultat possible ( bien que  vous pourrez obtenir  de bien meilleurs résultats que ceux  que je vous expose ) .

Dans  cette présentation  je reprends  certains protocoles qui  nous ont été offerts  par les membres  de MikrOscOpia .

Pour ceux qui  ont lu des livres anciens comme le Langeron ; le Locquin  et le   Seguy   les colorations  apparaissent  très complexes. Ces protocoles  ne sont pas  utilisables par les amateurs. Les produits  nécessaires  ne sont  disponibles que  pour des laboratoires  spécialisés   ayant un volume  d’ utilisation sans  mesure  avec  nos besoins .

 

Pour illustrer  mon propos   j’ai  fait une coupe de la tige de l’année  de la Prêle , des ovaires de la fleur de tulipe et des tiges de l’ année de Millepertuis .-

 

NB   -( la coloration des  champignons  n’est pas incluse dans les protocoles présentés )

                                                            *************************

Precautions  préalables :

 * toujours  travailler dans  des verres de montre.

* faire des  coupes  le  plus  mince  possible avec un microtome manuel  de Ranvier

*  Étape 1  Bain  dans Dakin  si on désire   découvrir  le squelette de la cellule  dans  les  formes de sa structure    pendant 5/ 10 minutes.

                                Si on désire regarder les organites intra cytoplasmiques   ne pas  utiliser  ce produit.

 

Bien rincer  avec  3 bains  d’eau  déminéralisée.

 

*Étape 2    Pour améliorer  la qualité de la coloration  faire  un bain de l’échantillon   : 2 possibilités :

*Vinaigre – le vinaigre a  un taux d’acide acétique entre 3 et 8 % (on peut l’utiliser en le diluant dans  un même volume d’eau)   ou  utiliser  acide acétique à 2 %   - 4 minutes

*AFA (Alcool 95 dénaturé  80ml + formol 40% (celui du commerce)  15cc +acide acétique glacial  (c’est son nom) 5 ml )   pendant  8 minutes.

*Etape 3 la coloration

D’emblée sont exclus  les colorants alimentaires  - les résultats  sont d’une grand pâleur  et  vraiment sans  intérêt   - de plus leur  prix est supérieur à un flacon de  carmin , de safranine ,ou de  bleu de méthylène  par exemple .

Quand on  veut  colorer  il faut  savoir effacer. Cela est vrai en dessin  comme  en botanique  .Il y a l’équivalent  d’une gomme    qui  régule   une coloration  un peu épaisse, un peu excessive :  c’est l’alcool chlorhydrique  

Très facile à  réaliser  (on trouve  les deux produits au rayon  droguerie)

   : Alcool 95 dénaturé: 10 cc   + Acide chlorhydrique de ménage : 1 cc. (ou 10 gouttes de l’ un pour  une goutte de l’autre)

Bien surveiller  car  très efficace  - Rincer à l’eau   quand  la couleur de la préparation  vous satisfait.

 

La coloration  a pour but de mieux distinguer les  parties constituant l’échantillon que l’on examine .Il y a  plusieurs possibilités

--on réalise une coloration monochrome  - c’est le plus facile avec les anciens colorants .

--on réalise   une coloration avec  deux produits différents  qui vont agir différemment en  fonction de la constitution de l’échantillon  - ce qui veut dire  que toutes les associations ne donnent pas forcement de résultats correctes  - Pour cela  plusieurs  étapes sont possibles .

(on réalise parfois  une coloration complexe faisant intervenir   3 à 4 produits .)

 

Les exemples :

                   (Les photos sont des panoramiques de 25 images)

 

Coloration :  Giemsa     rapide  ( Azur +Bleu de méthyléne + Eosine). ( il existe une forme  lente  du produit . Cela ne doit pas changer  grand-chose en  botanique  ( ce colorant est celui  utilisé pour colorer les globules blancs ) .

co texte 1.jpg

A noter le caractère bien coloré des noyaux cellulaires .

Mise en œuvre :

Étape 3

Bien rincer  avec  3 bains  d’eau  déminéralisée.

Mettre sur les  échantillons   3 gtt d’eau déminéralisée  puis    2 gtt de  Giemsa .

Attendre   4 minutes.

Bien rincer  avec  3 bains  d’eau  déminéralisée.

Si la coloration  est trop  forte     mettre  2 gtt d’alcool chlorhydrique.

Arrêter la réaction dès  que la coloration est satisfaisante.

Bien rincer  avec  3 bains  d’eau  déminéralisée.

Éosine aqueuse 2%    2 gtt   sur l’échantillon  - Laisser 1 minute.

Déshydrations alcool isopropylique 100.

Éponger le trop d’alcool sur la lame

Montage  dans  Euparal.

Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

Coloration avec l ' Etzold Bleu  ( Basic violet  / Chrysoidine /Bleu Astra )   .

Protocole de Klaus              

co texte 2.jpg

 

 

Mise en œuvre :

Étape 3 :

  • Rincer à l’eau déminéralisée  3 fois.
  • Etzole Bleu – Laisser agir 4 minutes.
  • Rincer à  l’eau déminéralisée 3 fois.
  • Si la coloration  est trop  forte 
  •      Soit  refaire  la préparation en diluant le produit  1 gtt du produit + 1 gtt d’eau
  •      Soit  Différencier  si la surcoloration est très intense    par mettre  2 gtt d’alcool chlorhydrique.  (mais méfiance : tout se décolore très vite)
  •      Soit mettre dans l’ alcool isopropylique 70%  (mais son action porte plus sur le rouge que sur le bleu.)
  • Arrêter la réaction dès  que la coloration est satisfaisante.
  •   Déshydration alcool isopropylique 100.
  •   Éponger le trop d’alcool sur la lame
  •   Montage  dans  Euparal.
  • Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

Coloration  avec Acridinerote /Acrifalvine    puis  bleu Alcian   .              Protocole  de Klaus

 

co texte 3.jpg

 

 

                Étape 3 :

                Rincer à l’eau déminéralisée  3 fois .

                Acriflavin/acridinrot - couvrir  l’ échantillon – Laisser agir    2 minutes .

                Rincer à  l’eau déminéralisée  3 fois .

                Bleu Alcian   - laisser agir  2 minutes .

                Rincer à l’eau déminéralisée  3 fois.

                Différencier  dans Alcool  isopropylique  70 (surveiller  le résultat) .

                ( Si la coloration est trop forte il est possible de diluer  les produits  utilisés :  1 gtt du produit + 1 gtt d’eau avant de  faire la coloration ).

                Déshydration  alcool isopropylique 100.

                Éponger le trop d’ alcool sur la lame.

                Montage  dans  Euparal.

                Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

Coloration  avec le Bleu de Méthylène / Eosine.

 

co texte 4.jpg

 

 

 

Coloration double de Pésez.

 Faire le mélange :

      --  Alcool isopropylique  à 99%  12 cc.

      --  Solution aqueuse d’éosine à 2% (pharmacie)   1,5 cc.

      --  Bleu de méthylène  aqueux 2 % (pharmacie)    0,5 cc.

                   Pour les mesures prendre une seringue de 1 cc et de 10cc (pharmacie)

 Cette préparation ne se conserve pas et doit être refaite avant chaque coloration.

 Si on réutilise  cette préparation le lendemain  on  obtient  la  coloration de l’échantillon de droite ci-dessus .

Étape 3

     Couvrir  l’échantillon  de quelques  gouttes du  mélange  environ 30 secondes  à 1 minutes pas plus.

       Rincer à l’eau déminéralisée.

       Déshydration  alcool isopropylique 100.

       Éponger le trop d’alcool sur la lame

       Montage  dans  Euparal.

       Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

 

Coloration  Safranine  simple et safranine bleu astra :

 

co texte 5.jpg

 

          Etape 3 :

          -    Rincer  dans  eau déminéralisée  3 fois.

          -    Safranine du commerce :  diluer ( 3 gtt de safranine + 3 gtt d’ eau .déminéralisée )    dans le verre de montre sur l’ échantillon -  Laisser agir 5 minutes .

            - Si  la coloration est trop  forte  différencier avec Alcool Chlorhydrique  ( voir   ci-dessus )

            - Rincer     3 fois  de suite

 

On peut  si on le désire associer  le bleu Astra

            -  Même  protocole  que  précédemment avec la Safranine.

            -  Astra bleu   3 gtt  - Laisser agir  20 secondes   est un grand maximum.

             - Déshydration  alcool isopropylique 100.

             - Éponger le trop d’alcool sur la lame.

             - Montage  dans  Euparal.

             -Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

Coloration vert  de Mirande  (Vert de méthyle + Carmin ).

 

co texte 6.jpg

 

 

 

Mise en œuvre

Etape 3

              - Rincer  3 fois à l’ eau déminéralisée ;

              - Couvrir l’échantillon avec  4 gtt  du vert de Mirande.

              - Laisser agir 10 minutes .

              - Rincer 3 fois à  l’ eau déminéralisée.

             -  Déshydration  alcool isopropylique 100.

             -   Éponger le trop d’alcool sur la lame

             -  Montage  dans  Euparal.

             -  Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

 

 Coloration  Carmin  aluné :

 

 


co texte 7.jpg

 

  Étape 3

   Bien rincer à  l’eau déminéralisée  3 fois .

   Dans un  verre de montre mettre sur l’ échantillon   quelques  gouttes de carmin aluné .  Laisser     30minutes à 1 heure .

   Rincer  l’eau déminéralisée 3 fois .

   Déshydration  alcool isopropylique 100.

  Éponger le trop d’alcool sur la lame.

   Montage  dans  Euparal.

   Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

Coloration Carmin acétique + vert  de méthyle .

co texte 8 .jpg

 

 

  Étape 3 :

  Bien rincer à l’eau déminéralisée 3 fois.

  Couvrir l’échantillon avec quelques gouttes de Carmin acétique – laisser agir 2 heures .

   Préparer dans un verre de monte  Eau 8 gtt + Vert de Méthyle 2gtt.

   Retirer le Carmin et sans  rincer couvrir l’échantillon avec la préparation   - Laisser agir entre 15 et 30 secondes pas plus ++.

   Retirer l’eau  et dans le verre de montre  couvrir l’échantillon avec  le mélange

Eau  40 cc + 3 gtt de liquide vaisselle.

   Chauffer au  bain marie  la gélatine  glycérinée pour la rendre liquide

   Mettre  une goutte  de gélatine sur une lame.

   Vider l’eau du verre de montre  et faire glisser l’échantillon    dans la gélatine glycérinée  - et en ajouter  une goutte sur l’échantillon.

    Couvrir avec  une lamelle 

    Si la manipulation a été  bien faite  il n’y a  pas de bulle d’air.

    Laisser  refroidir .

    Le lendemain  luter les bords   de la lamelle  avec  une couche de vernis à ongles .

.

 

Carmin acétique + vert d’ iode

 

Je n’ ai  pas trouvé de fournisseur  présentant un  vert d’ iode  qui colore correctement   - Celui  vendu  pour les cours SVT  dans les collèges  est trop dilué .

 

 

 

Coloration Violet de gentiane / Eosine .

 

co texte 9.jpg

 

(La coloration n’est  pas très  homogène  mais ici ce n’est pas gênant  pour la présentation)

Après  fixation  

Rincer  3 fois avec  eau déminéralisée

Éosine aqueuse  2%   7 minutes

Rincer  3 fois

Violet de gentiane  -il faut trouver la bonne dilution -   ici j’ai  dilué au ¼   2 gouttes de violet pour 8 gouttes d’ eau  déminéralisée     30 secondes  (  au-delà le bleu écrase le tout – c’est d’ ailleurs  le problème  avec tous les  bleus  qui ont un pouvoir écrasant très  important) .

-Si nécessaire  différencier dans l’ alcool isopropylique 70 %  puis  100 %  - bien surveiller

.

  Déshydratation avec alcool isopropylique 100  le  temps de passer les échantillons sur la lame.

 Éponger le trop d’alcool sur la lame .

 Monter à l’ Euparal

 . Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

 

 

 

Coloration au Bismark .

co texte 10.jpg

 

 

Après  fixation.

Rincer 3 fois avec eau déminéralisée.

Couvrir l’échantillon avec  quelques  gouttes de Bismark  -  laisser 10 minutes mais on peut laisser plus il n’y a pas de risque de surcoloration.

Déshydrater avec alcool  isopropylique 100%.

Déshydratation avec alcool isopropylique 100  le  temps de passer les échantillons sur la lame.

 Éponger le trop d’alcool sur la lame.

 Monter à l’ Euparal.

 Mettre un poids sur la lamelle   (   3 boulons). Et laisser ¼ d’heure.

 

Je vous ai présenté  quelques  solutions à  ce problème  de  colorations  pour  ceux qui n’ en ont  jamais réalisées –le sujet est important  il sera  à creuser tranquillement .

 

 

Au montage la difficulté avec les bulles d’air .

 

Pour éviter les  bulles   d’air qui sont toujours présentes , il existe  des solutions  imparfaites .  Le  fait de faire un bain dans un  alcool  Isopropylique  100, suivi d’un montage  avec  l’ Euparal ou du baume du canada , limite déjà  le nombre  de bulles  car  ces deux produits  sont friands en   oxygène  - Une fois que  vous avait mis  le milieu de montage sur l’ échantillon ,  avant de placer la  lamelle , tapoter un  peu  l’ échantillon avec une petite  tige métallique  .Cela fait fuir les  bulles   - Poser ensuite la  lamelle   - Placer sur la lamelle  un poids de quelques  grammes   pendant  ¼ d’heure. Les bulles  disparaissent  en 24 heures.

 Autre technique  mettre 1 à 3  gouttes  de liquide vaisselle  dans  ½ verre d’ eau  Faire tremper l’ échantillon   et  monter  avec la gélatine  glycérinée en  procédant  comme  on vient de le voir.

.

 PS :(Pour la déshydratation dans les livres anciens  vous  rencontrez des protocoles avec  des passages   dans   des alcools  30 - 60 - 90  où l’ inverse ;  passer au 100 directement ne change rien  à  l’ affaire mais il n’est pas interdit de  faire du  progressif ou du dégressif .) L’ alcool  isopropylique 70%  enlève les couleurs . L’ alcool isoprpopylique 100 ne modifie  rien .

 

https://forum.mikros...on/?hl=colorant

 

 

Liste des autres colorants utilisables :

 

la Phloxine B alcoolique (elle colore en mauve violet)

le Rouge Congo SDS  en mycologie

le Rouge neutre (il colore en rose rouge)

la Fuchsine phéniquée de Ziehl, préparée à base de fuchsine basique (elle colore en bleu violet et peut être régressée avec de l’acide chlorhydrique à 5 %)

Rouge neutre                        - Colore les vacuoles

Orcéine acétique                  - Colore les chromosomes de racines des liliacées

Lugol                                      - Colore les noyaux des cellules végétales et met en évidence les grains d'amidon

Ziehl Nielsen                - Colore les membranes cutinisées.

Rouge de ruthénium     - Colore les composés pectiques.

Soudan III                     - Colore en rouge les lipides

 

Référence :

Liste des colorants possibles

http://wwwpsvt.free....s.htm#colorants

 

 

PS : La grande difficulté est de trouver des fournisseurs qui acceptent de vendre aux particuliers des produits correctes     -  une liste de fournisseurs est disponible  m’écrire : Forum – Cliquer sur la photo – Rubrique : écrire un message).

 

 Dominique .

 

 


Modifié par Dominique., 21 avril 2020 - 10:04 .

  • 0

#2 Buteo

Buteo

    Anthropoïde

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  • 833 messages

Posté 22 avril 2020 - 09:05

Bonjour Dominique,

il faudra qu'on te décerne  la rosette du  "Leuuwenhoek d'or"

 

Philippe


Re-

j'ai essayé de t'envoyer un MP mais impossibilité, il y a un pb (changé qqch qui ferait que le lien ne se fait pas ?)

J'avais déjà essayé il y a qq tps avec le même résultat nul. J'en avais conclu que tu ne voulais pas être ennuyé par des MP, ce qui ne semble pas être le cas.

je te contacte d'une autre façon.

Ph.


  • 0

#3 Dominique.

Dominique.

    Purgatorius

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  • 785 messages

Posté 22 avril 2020 - 11:08

 Bonjour Buteo

       

                   Merci beaucoup

                   C' est  ennuyeux ce que  tu  me  dis là : de ne pas être  joignable  par les messages personnels de MikrOscOpia.

                   Mon Email  : biarrat.dominique@wanadoo.fr

 

                            Amicalement

                                                   Dominique.


  • 0

#4 Buteo

Buteo

    Anthropoïde

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Posté 22 avril 2020 - 12:22

Je t'ai envoyé mon adresse mail par SMS (envoi à 10 h 07).

Ton adresse servira à qui voudra de toute manière.

Philippe


  • 0

#5 JPL80

JPL80

    Procaryote

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Posté 22 avril 2020 - 12:51

Bonjour Dominique

Cette présentation synthétique des colorants et procédures associées est bienvenue.

Ps. J'avais moi-même essayé de te contacter par courriel (à propos des problèmes de coupe dans la paraffine que je rencontrais) sans y parvenir.

Je prends donc note de ton adresse à toute fin utile.

Et à nouveau merci pour ce que tu apportes aux petits microscopistes que nous sommes.

JPL80


  • 0

#6 Klaus Herrmann

Klaus Herrmann

    Invertébré

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Posté 22 avril 2020 - 02:48

Bonjour Dominique,

 

excellent cet sommaire de l´usage des colorants et les protocoles pour les debutants. C´est vraiment une mine!

 

Je me permets de corriger une petite chose: L´Euparal est très bien pour faire des preparations longue durée. Je le connais maintenant 40 ans.

Mais la durée de solidification du résin est plus longue: à temperature de 20° il faut aux minimum une semaine. Moi j´ètuve les lames environs une nuit à 50-60° chargé d´un petit aimant - naturellement il faut sous les lames un plateau en fer.

Mais la méthode boulons est aussi parfait.

 

800_IMG_0011.jpg

 

800_IMG_0022.jpg


  • 0

#7 Daniel Crabbé

Daniel Crabbé

    Eucaryote

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  • 219 messages

Posté 23 avril 2020 - 04:41

Un grand merci Dominique pour ce travail de synthèse.

 

Amicalement.

 

Daniel


  • 0

#8 Jean-Marc Babalian

Jean-Marc Babalian

    Homo sapiens microscopicus

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  • 2 517 messages

Posté 24 avril 2020 - 07:59

Hello Dominique,

 

Très intéressant et didactique,

 

Merci

 

JM


  • 0

#9 Claude Calice

Claude Calice

    Procaryote

  • Membre confirmé
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Posté 24 avril 2020 - 09:35

Bonjour dominique,

merci pour ce travail de synthèse bien documenté,

cordialement,

claude,


  • 0

#10 scrophulaire

scrophulaire

    Eucaryote

  • Membre confirmé
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  • 242 messages

Posté 24 avril 2020 - 09:00

Bonjour Dominique,

Très belle présentation des principaux types de coloration de végétaux.


Je me pose une question sur le protocole de préparation des coupes avant coloration.
Tu dénatures les cellules ( vide le plasma) au dakin puis on fait un bain au vinaigre pour acidifier la cellule ce qui améliore la fixation du colorant: là ok
Mais pourquoi le AFA?
Ok il est un peu acide mais bon, normalement on l’utilise comme fixateur ( gélifier ou agglutiner les protéines) donc:
Soit on l’utilise pour conserver le plasma mais on ne dénature pas au dakin.
Soit on l’utilise avant de dénaturé mais je pense que ça ne sert à rien car la cellulose, lignine sont des polymères stables.

Reste le sulfate de cuivre qui peut formé une laque avec les colorants mais il n’est pas réputé pour ça. Il faudrait plus essayer avec de l’alun ou iodure de potassium ou chlorure de mercure ?

Salutations
  • 0

#11 Dominique.

Dominique.

    Purgatorius

  • Membre AUTEUR
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  • 785 messages

Posté 24 avril 2020 - 11:02

Bonsoir

 

 

L’origine de l’information  vient de

ww.microscopies.com  un article de Jean- Marie Cavanihac  . Il  faisait la présentation des réactifs en microscopie et parmi les fixateurs  il notifiait l’AFA   et l’alcool acétique. La même notification    était donnée par Jean Lachapelle    dans la revus du cercle mycologique de Bruxelles N°4 (2004 )

Comme  à  ce moment-là  j’avais de l’ AFA au Labo je l’ ai utilisé  en botanique.    J’ avais  alors  noté que le  résultat  était  satisfaisant  , j’ai gardé  la formule  sans trop  me poser de question de biochimie . L’ AFA   contient la  dose idéale d’ acide acétique  et représente une sorte de fixateur universel   pour l’ histologie  animale  - la mycologie   et la botanique .

L 'Afa  est de plus facile à utiliser .

 

Ta proposition d' utilisation de L' Alun  me semble d'un grand intérêt   - as-tu  le protocole de dilution  de  l' alun   ( - j' en ai en cristaux .) -   de même j' ai de l' iodure de potassium  - protocole ?

 

Merci  de ton aide .

 

Amicalement

                     Dominique .


Modifié par Dominique., 24 avril 2020 - 11:11 .

  • 0

#12 scrophulaire

scrophulaire

    Eucaryote

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  • 242 messages

Posté 27 avril 2020 - 05:52

bonjour,

 

 

j'ai re-lu les protocoles et pour pour moi il manque un détaille mais qui est essentielle dans les colorations métachromatique et panoptique (dans ton cas le Giemsa). L'eau déminéralisé (bien) doit surtout être neutre. En général les laboratoires utilise des tampons à ph  7. Pas défaut prendre de l'eau en bouteille à ph 7 (écrit sur les étiquettes à l’arrière) ou en faire.

 

Eau Neutre : Prendre de l’eau pour fer à repasser (déminéralisé) et mettre quelques cristaux de rouge neutre.

Préparer à coté: de l’eau pour fer à repasser avec de l’acide acétique à 1% et de l’eau pour fer à repasser avec  du carbonate de soude à 1%.

Ajuster jusqu’à ce que l'eau soit orangé = pH7.(sinon jaune ou rouge). Pour apprécier la couleur prendre du verre transparent et une feuille blanche derrière.

 

Salutation


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