Aller au contenu


***** Bienvenue dans le forum MikrOscOpia ! *****
Photo
- - - - -

COLORATIONS


  • Veuillez vous connecter pour répondre
4 réponses à ce sujet

#1 scrophulaire

scrophulaire

    Eucaryote

  • Membre confirmé
  • PipPip
  • 242 messages

Posté 26 avril 2020 - 11:13

Bonjour,

 

Pour répondre à Dominique, voici les principes de coloration en microscopie. Bonne lecture.

 

Colorants directs :

Il n'y a qu'à mettre le colorant en présence de la substance, dans un milieu convenable (solution) :

· Pour les colorants dits "substantifs", des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals suffisent. En général, ce type d'association est faible et la teinture n'est pas solide.(avec le bleu de méthylène sur cellulose ou fibre protéinique). Cependant, si les dimensions de la molécule de colorant sont adaptées à la structure du produit à teindre, on obtient un résultat convenable. C'est le cas de plusieurs bis-azoïques sur la cellulose. Ainsi le rouge congo teint parfaitement la cellulose.

· Pour les colorants acides et basiques, il s'agit de véritables réactions chimiques acide-base avec des fonctions présentes sur le support.

Colorants acides :Leur molécule comporte une ou plusieurs fonctions acide ; en solution il apparaît donc des anions -CO2 - , -SO3- , -O- …..d'où leur appellation : colorants anioniques.Ils forment des liaisons ioniques avec des supports à sites cationiques, essentiellement –NH3+ et plus généralement des fibres protéiniques ou des polyamides en milieu acide.

exemple l'acide picrique, safran sont des acides fort.

Colorants basiques : Ils comportent des cations d'où leur autre appellation : colorants cationiques, essentiellement NH3+ . Ils forment des liaisons ioniques avec des supports à sites anioniques, notamment les -CO2 - , -SO3- , -O-.exemple le violet cristal, vert malachite

· Avec les colorants dits "réactifs", il se produit une réaction chimique entre le colorant et la substance, Il s'établit des liaisons covalentes. La teinture est très résistante mais ce procédé n'est pas très courant car il met en jeu des molécules qui ne sont pas très répandues.


 

Colorants par mordançage :

La fixation du colorant s'effectue par l'intermédiaire d'un "mordant", espèce qui assure le lien entre colorant et la substance. Le mordançage augmente l’affinité du colorant pour les structures à colorer (élective). Il peut changer la couleur finale de la coloration (différentiation). En pratique, le choix de la méthode repose sur diverses considérations : possibilité de réaction, teinte recherchée et également toxicité de certains éléments (Cr3+). On distingue

Onchrome : Le mordant est appliqué en premier, suivi du colorant. L'hématoxyline de fer de Heidenhain en est un exemple classique.

Métachrome : Le mordant et le colorant sont mélangés puis appliqués. Des solutions d'hématoxyline d'alun sont appliquées comme ceci. C'est probablement la façon la plus courante d'utiliser des colorants mordants en histotechnologie.
Afterchrome : Le colorant est appliqué en premier, suivi du mordant. Ce n'est pas souvent appliquer en histotechnologie,


 

1) Mordant Oxydants : Les mordants Oxydant on pour rôle de neutraliser les tissus réducteurs qui empêchent la coloration. Ces intermédiaires sont de deux types :

· Oxydants métalliques : Les ions métallique : Al3+, Cr3+, Fe3+, ou Fe2+, Cu2+ chélaté sont relié à la fois à la substances et au colorant. Les mordants sont

-soit des fixateurs à base de sels chromiques (Ac Chromique), d'acétate d'aluminium, de sels ferriques, de sel Osmique:Fixateur de Van Tellyesniczky, Fixateur de ZENKER soit des solution, Fixateur de HELLY. (On utilise Ac Chromique (K2Cr2O7 )mais c’est Cr3+ qui est présent dans le complexe ; la réduction peut se faire grâce à l’acide formique (COOH réducteur ) employé pour ajuster le pH.)

-Soit des solutions a appliquer avant les colorants : d'alun, Phosphomolybdique, Phosphotungstique, azoique. Agit dans la différenciation


 

· Polyphénol :Les liaisons font intervenir les doublets des atomes d'oxygène, donneurs d'électrons -OH, -O - .Ou encore les hydrogènes des –OH (liaisons hydrogène).

-soit des fixateurs ex Bouin l' Ac Picrique est un mordant et différenciateur avec des colorants acides.

Ex le formol :AFA de LOcquin

- Soit en Solution dans les colorants : l'aniline : safranine et violet de gentiane aniliné, l'ac phénique : Cristal violet Phéniqué (dans les colorants bactériologique),

Les Tanins agissent avec les colorants acide (orange G...) pour différentier les couleurs basiques qui donnent des sels polyacide solubles. Les tanins sont des polyphénols présents en abondance dans certains arbres : chêne (notamment dans les galles), châtaignier. Ce sont des hétérosides mais leur hydrolyse libère facilement deux molécules fondamentales : l'acide Gallique et l'acide ellagique. Par leurs multiples fonctions phénol ou phénate (en milieu alcalin) ils peuvent produire des chélations ou donner des liaisons hydrogène, autant de "dents" pour accrocher la cellulose ou les protéines d'une part et certains colorants d'autre part.

L'ac gallique est utilisé dans les coloration argentique,


 

2) Mordant Métalloïde :

· Métallique Incorporé : Le principe est de faire agir un sel métallique à chaux sur un colorant de base. Le colorant est dit « pré-métallisé » par chélation du sel sur la molécule colorante. Il forme une sorte de gel que l'on appel une Laque. Une laque est défini comme un complexe de coordination formé entre un ion métallique polyvalent et certains colorants. (même principe que l'hémoglobine). Souvent l'incorporation du sel entraîne un changement de couleur très soudaine et spectaculaire.

Alun de potasse (sulfate double d'alu et de K) et alun de fer ( sulfate double d'alu et de sesquioxyde de fer). Il forme une laque (intensifie la couleur) avec Hematoxyline et l'ac carminique qui on des propriétés électives. (Alun de fer)

· Métallique dissociable : Ce sont des colorants qui se fixent sur les substances mais qui ne donnent une teinte définitive stable qu'après avoir été trempés dans une solution d'ions métalliques ( sels basiques ou des sels neutres insolubles).

-soit des fixateurs : le sulfate de Cu de sulfate de cuivre (CuSO4). Chlorure de platine, de zinc, de mercure : Fixateur de Helly, FAA

- Soit en Solution avant coloration : Permanganate de potassium (cytologie), Iode (cristal violet en bactériologie).

- Soit en Solution après coloration : sulfate de fer (coloration à l'argent), Iode : utiliser sous forme de lugol ou teinture soit pour renforcer les couleurs (vert de méthyles, bleu victoria).

Il faut l'éliminer par lavage à l'eau car il détruit les colorations.


 


 

3) Mordants Basiques : ce sont des accentuateurs de colorants. On trouve le carbonate de potassium, l'ammoniaque, bicarbonate de soude, potasse caustique, borate de sodium. Dilution (1/10000)


 


 


 

Colorants au soufre :

On réserve l'appellation "colorants au soufre" à des substances organiques soufrées qui teintent les subtances parce qu'elles ont été retenues au sein de celles-ci grâce à une insolubilisation.

Le produit de la fixation du soufre sur une molécule appropriée (parfois un mélange de deux molécules différentes) est insoluble dans l'eau. On peut lui donner une forme soluble en le réduisant par action du sulfure de sodium en milieu alcalin. Il est alors apte à être absorbé par la substance.


 

Utilisé dans les colorations argentique avec

Soufré : métabisulfite de potassium, hyposulfite de sodium

Colorant nitrate d'argent ou chlorure d'or (osmium ou platine en microscopie électronique)

Oxydant hydroquinolone, formol


 



 


  • 0

#2 Dominique.

Dominique.

    Purgatorius

  • Membre AUTEUR
  • PipPipPipPipPipPipPip
  • 785 messages

Posté 26 avril 2020 - 08:24

Bonsoir

 

Merci Scrophulaire de  toutes  ces notions de chimie  qui ont l’avantage d’organiser nos idées sur un sujet   qui n’est pas facile.

En regardant  le Seguy   j’ ai  trouvé  les dilutions   utilisables pour l’ Alun de potasse  et l’ iodure de potassium   - De ce fait  d’ ici  15 jours   je vais faire un petit article comparatif  entre Alun  de potasse – iodure de potassium    avec la fixation par  l’ AFA .

 

Amicalement

                                       Dominique


  • 0

#3 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

  • Membre confirmé
  • PipPipPipPipPipPipPipPipPipPip
  • 15 764 messages

Posté 23 décembre 2021 - 09:41

Bonjour à tous,

 

Comme promis, voici ma réaction à cet article sur les colorations en microscopie.

A l'origine : https://forum.mikros...?hl=colorations

sans oublier :

https://forum.mikros...?hl=colorations

https://forum.mikros...ions#entry71633

 

Et bien d'autres quand on utilise le moteur de recherche du forum.

Donc vaste sujet.

 

Le contraste de phase le DIC et autres modulateurs pupillaires sont aussi de bons moyens pour augmenter la visibilité des sujets.

Mais rien ne remplace la coloration si l'on veut un diagnostic précis.

 

Un exemple : Il est assez facile pour un habitué, de reconnaitre un Polynucléaire Eosinophile sans aucune coloration, sur sang frais, mais avec une coloration utilisée en laboratoire d''Hématologie on y arrive beaucoup plus facilement et sans cause possible d'erreur. (Voir exemple plus bas)

Cela permet surtout de faire des Formules Leucocytaires dont l'utilité peut être vitale, contrairement à la microscopie touristique qui ne poursuit pas les mêmes buts.

Par contre, dans le même domaine de l'Hématologie, il est indispensable d'utiliser la chimie pour déterminer le stade de développement d'un lymphocyte.

Tout dépend donc du but que l'on se fixe. 

Et Mikroscopia ne se limite pas à des observations à motivations naturalistes.

 

4-20211129154934706-2.jpg

Cliquez pour l' Echelle Un

 

Amicalement.


  • 0

#4 Dominique.

Dominique.

    Purgatorius

  • Membre AUTEUR
  • PipPipPipPipPipPipPip
  • 785 messages

Posté 23 décembre 2021 - 08:26

    Bonsoir Tryphon

 

                                                        Belle préparation

 

Coloration de May-Grunwald et Giemsa

 

Fixer le frottis (étalement mince d’une goutte de sang en utilisant une lamelle).

Pour  fixer   on verse un peu d’éthanol sur l’étalement  et en laissant 3 minutes.

 

Préparation des colorants

Colorant May-Grünwald   

Faire  mélange     50% eau tamponnée  + 50%May-Grünwald.  (   Ph de l’eau  entre 6,8 et 7 ).

Dilué le Giemsa    1 mesure  de Giemsa pour 9 volumes d’eau tamponnée.

   (Ne se  conserve pas   donc à préparer au dernier moment).

 

Couvrir la lame de colorant de May –Grûwald dilué et laisser  5 minutes.

Égoutter le colorant   sans rincer et le remplacer par le Giemsa dilué  - Laisser agir 10 minutes

Après 10 minute  laver la lame  sans  l’incliner avec de l’eau tamponnée  de façon à enlever le colorant

Laisser l’eau propre sur la lame  2 à 3 minutes pour obtenir  une couleur différentielle.

Ensuite laisser égoutter l’ eau  et faire  sécher la lame  sur un râtelier  ou autre .

                                                     *******************************

Pour faire un frottis : http://perso.numeric...2-3 TP Sang.pdf

Pour les colorants : .https://www.socimed.com/giemsa-r-rapide-125ml.html

https://www.socimed....sine-125ml.html

                                                                                     Pb il n’y a pas à moins de 125 ml

 

Dominique.

 


  • 0

#5 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

  • Membre confirmé
  • PipPipPipPipPipPipPipPipPipPip
  • 15 764 messages

Posté 24 décembre 2021 - 09:40

Bonjour,

 

Pour ne pas rester sur une impression erronée, je voudrais apporter quelques précisions rapides .

 

On parle souvent d'amateurs et de professionnels, les mots sont TRES mal choisis.

On devrait parler de personnes rigoureuses et non rigoureuses (les touristes de la science).

 

Il existe une infinité de moyens de colorer les cellules sanguines , chacun peut inventer la sienne.

Le problème  c'est qu'en Médecine, il faut que les méthodes soient REPRODUCTIBLES d'un bout de la planète à l'autre.

Nous utilisons en laboratoire la Méthode de PAPPENHEIM  appelée chez nous May-Grunwald Giemsa (MGG) décrite ici https://www.microsco.../TPM-2/MGG .htm (1) Les "Anglo-Saxons" utilisent une autre technique dont les résultats ne sont pas rigoureusement identiques. (2)

 

Le principe de la methode de PAPPENHEIM est le suivant.

 

Le MAY-GRUNDWALD    est une solution alcoolique de deux colorants INACTIFS.

Elle sert dans un premier temps à la fixation du frottis.

Dans un deuxième temps on rajoute au colorant ,directement sur la lame de l'eau tamponnée.

C'est à ce moment là qu'un "miracle" se produit!

Les deux colorants se dissocient et deviennent ACTIFS, ils colorent les cellules sanguines.

Les éléments acidiphiles et neutrophiles sont colorés.

 

Le GIEMSA ajouté après rinçage de la première solution va colorer les cytoplasmes .

 

Ici, j'ai utilisé une autre methode utilisée par les vétérinaires, plus simple à robotiser mais les résultats ne sont pas aussi bons !

 

(1) Je suis scandalisé de retrouver mes publications sous forme payantes et sous d'autre noms.

Comparez le lien que j'ai donné avec celui-ci : https://fr.scribd.co...S-TPM-2-MGG-Htm

 

(2) Les Américains utilisent principalement la Coloration de Wright (ou Wright-Giemsa), les Anglais utilisent la methode de Leishman  , toutes deux tirées de la methode originale de de Romanowski  et les Français celle de May-Grunwald Giemsa (MGG) qui correspond à la methode de Pappenheim.

 

 

Amicalement.

 

Passez de bonnes fêtes.


  • 0




N'oubliez pas de consulter notre Magazine en ligne ... MIK-MAG!