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larve de chironome : chromosomes géants


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8 réponses à ce sujet

#1 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 10 juin 2021 - 08:59

Bonsoir à tous,

 

dans le même esprit que mes essais d'observations des chromosomes de la mitose de racine d'ail j'ai découvert qu'il y a aussi des manips sur l'observation des chromosomes des glandes salivaires des larves de chironomes (vers de vase dans le langage courant en aquariophilie).

 

Il y a un protocole assez simple qui implique du carmin acétique ou du vert de méthyle acétique.  Je n'en ai aucun des 2 donc après quelques tentatives infructueuses avec du bleu de méthylène , de toluidine ou du violet de gentiane  j'ai pensé à l'orange acridine qui montre l'ADN et l'ARN en fluorescence verte ou orange.

 

Donc voilà mes 1ers essais .  On voit assez bien les chromosomes géants ( chromosomes polythènes) .  On trouve se type de chromosome dans différents organes des diptères au stade larvaire mais le TP le plus courant est celui des glandes salivaire de larve de drosophile et de chironome.

 

La manip d'extraction des glandes est simple à la bino à condition d'utiliser une aiguille très fine (seringue 2mL) et une pince fine pour étirer le corps pendant que l'aiguille fixe la tête.

 

Si certains d'entres vous connaissent bien cette manip je suis ouvert à toute améliorations car la coloration classique donne généralement de meilleurs résultats. 

 

malgré tout on arrive tout de même à distinguer les bandes sur le long chromosome en ruban dans le noyau de la cellule.

 

10 juin 21 chironomes chromosomes essai 1 epi.jpg

 

10 juin 21 chironomes chromosomes essai 2 epi.jpg

 

10 juin 21 chironomes chromosomes essai 3 epi.jpg

 

Chris

 

 

 

 

 

 

 


Après un stacking et sharpening j'obtiens ceci : les bandes sont très visibles :

 

chromosome géant essai1 sharp.jpg

 

 


  • 0

#2 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 11 juin 2021 - 07:15

Bon !  je viens de comprendre comment avoir de bons résultats et pourquoi :

 

La clé essentielle que les protocoles de disent pas :   FIXER et PRECIPITER l'ADN

 

Tous les protocoles que j'ai trouvé colorent directement les chromosomes avec l'acéto-carmin   ou le vert de méthyle acétique...

 

Je n'en ai pas  MAIS :   j'ai fait un mélange  alcool  à bruler + acide acétique (ménager 14°) dans les proportions  4 +1 comme le liquide de carnoy qui permet de fixer l'ADN.

 

Le résultat a été que :  après avoir extrait les glandes salivaires dans une goutte d'eau sur la lame de verre , je verse 1-2 gouttes du mélange sur les glandes salivaires et immédatement on voir les structures apparaitres et les chromosomes deviennent visibles même sans les colorer (observation sous la bino).

 

J'ai ensuite juste ajouté quelques micro grains de orange acridine et voici les résultats !!

 

 d'abord juste AVANT  addition du liquide de fixation :

 

11 juin 21  glande salivaire SANS fixation.jpg

 

 puis APRES ajout du mélange alcool-acide acétique :

 

11 juin 21 glande salivaire AVEC fixation 2.jpg

 

 

Et avec le colorant :

 

 

 

 

 

 


11 juin 21 chromosomes chironomes x10.jpg

 

11 juin 21 chromosome chironome epifluo ++++.jpg

 

11 juin 21  chromosomes chiironome x40 epifluo.jpg

 

 

 

 


11 juin 21  chromosome chironome ++ x16.jpg

 

11 juin 21 chromosome chironome x40  bis.jpg

 

 

Donc il semble que la fixation -précipitation soit essentielle pour de bon résultats.

 

Je vais faire des essais pour voir si l'acide acétique est essentiel ou non et si maintenant si je peux utiliser mes colorants habituels (bleu méthylène, bleu toluidine...)

 

à suivre

 

 


  • 0

#3 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 11 juin 2021 - 07:27

11 juin 21 chromosome chironome x40 ++.jpg


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#4 Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

    Homo sapiens microscopicus

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Posté 11 juin 2021 - 07:32

Très belle observation  :)


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#5 Jean-Marc Babalian

Jean-Marc Babalian

    Homo sapiens microscopicus

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  • 2 429 messages

Posté 11 juin 2021 - 08:08

Salut Chris,

Encore une fois, très jolie, et comme tu sors des protocoles classiques, c'est d'autant plus intéressant !

 

JM


  • 0

#6 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 11 juin 2021 - 08:19

merciiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii :)

 

Là je viens de faire des essais avec fixation à l'acide acétique pur seul : ça fonctionne aussi mais le colorant n'a commencé à prendre qu'apres rinçage à l'eau.

 

ici avec du violet de gentiane..

 

C'est pas mal je trouve mais la vision des chromosome est moins fine ce qui est surement dut à l'acide acétique seul.  Dans la littérature sur le fluide de Carnoy il est dit que l'acide acétique en plus de conserver l'ADN le fait "gonfler" et ajouté à l'alcool pour éviter le rétrécissement induit par l'alcool.

 

11 juin 21 chromosome chironome fixation acetique violet gentiane x20.jpg

 

21 juin 21  chromosome chironome fixation acétique violet x20 2.jpg

 

21 juin 21  chromosome chironome fixation acétique violet x20 3.jpg

 

 reste maintenant à tester en alcool seul...

 

 

 

 

 

 


  • 0

#7 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 11 juin 2021 - 09:17

bon j'ai refait un test après fixation alcool-acide acétique : il faut bien rincer avant de colorer . Ici je colore au bleu de toluidine mais les résultats ne sont pas bons : perte de définition.  Je referai des essais plus tard avec d'autres vers que je met à fixer au froid en alcool -acide pendant tout le we.

 

11 juin 21 chromosome chironome fixation alcool acétique bleu toluidine  x10  2.jpg

 

21 juin 21  chromosome chironome fixation acétique violet x40 3.jpg

 

 

 

 


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#8 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 16 juin 2021 - 02:47

Bonjour à tous,

 après quelques expérimentations j'ai obtenu ces résultats d'observation en champs clair avec le protocole suivant :

 

1) prélever les glandes salivaires

2) mettre quelques gouttes de fixateur acide acétique/alcool  [1 part pour 4] et attendre quelques minutes en veillant à ce que le liquide ne s'évapore pas

3) remplacer le fixateur par de l' HCl à 1 mol/L (environ ; pas besoin que la concentration soit parfaite)

4) attendre quelques minutes et rincer (sans perdre l'échantillon : ça faillit m'arriver)

5) ajouter 1-2  gouttes d'eau et colorer au bleu de méthylène  (solution assez claire)

 

Cette fois les chromosomes sont bien visibles et les gènes (bandes ) mieux définis que lors de tous mes essais précédents au bleu de toluidine..

 

16 juin 21  chromosome fixation hydrolyse BM  x20.jpg

 

16 juin 21 chromosome x40 BM.jpg

 

16 juin 21  chromosome fixation hydrolyse BM  x20  2.jpg

 

 


16 juin 21 chromosome chironome fixation hydrolyse bleu méthylène x40.jpg

 

16 juin 21  chromosome fixation hydrolyse BM  x40.jpg

 

 


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#9 chrisimbee

chrisimbee

    Procaryote

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Posté 16 juin 2021 - 03:07

16 juin 21  chromosome fixation hydrolyse BM  x20++  2.jpg

 

16 juin 21  chromosome fixation hydrolyse BM  x20++2  2.jpg

 

Quand le bleu de méthylène prends bien les résultats deviennent meilleurs

 

J'ai l'impression que ça dépends pas mal localement de la présence résiduelle d'HCl...je continue les essais en neutralisant au bicarbonate de sodium par ex; rinçage puis coloration..

à suivre..


Modifié par chrisimbee, 16 juin 2021 - 03:09 .

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