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Essai de coloration double. Safranine - Bleu Astra.


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21 réponses à ce sujet

#1 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 24 novembre 2022 - 07:38

Bonjour toutes et tous !   :)

 

Dominique, j'ai reçu la Safranine.

 

Voici un premier essai avec une coupe transversale de tige de Crassula ovata.
J'ai eu bien du mal, la Safranine est hyper concentrée, même diluée 1 Gt de colorant et 1 Gt d'eau la coupe noircissait immédiatement.

J'ai dû la diluer en 1/50.

En surveillant la couleur de visu, j'ai fait un bain de 2 min.

De même pour le bleu azur, dilution 1/20, bain 5 min

 

Voici ce que cela donne :

 

Vue d'ensemble :

crassula-safranine-1.JPG

 

Objectif 4x :

crassula-safranine-2.JPG

 

Objectif 10X :

safranine-1x10.JPG

 

Amitiés

Patrick

 


 

Bonsoir Patrick

 

  Ta coloration  malgré les dilutions  reste  trop forte.

  Dans le  Seguy  il est recommandé  de décoloré avec l’alcool chlorhydrique

  J’utilise  la  formule  suivante :

Alcool à 99  30 gtt

Acide chlorhydrique  de ménage   4  gtt

 (Certain rajoute 10 gtt d’eau) ce que  je ne fais pas.

Tu laisses  ton échantillon jusqu’ à ce qu’il  soit  rose.

Le bleu  est dominant   combien de temps  l’as-tu laissé agir.  (le bleu se décolore  très mal)

 

Dans le Seguy  article   1861  il propose  une  importante dilution de l’acide chlorhydrique   mais il part d’acide chlorhydrique  concentré

 

Amicalement

       Dominique

 

Merci Dominique,

Je vais refaire une tentative.

 

Amitiés

Patrick


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#2 Patrick-06

Patrick-06

    Procaryote

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Posté 25 novembre 2022 - 07:28

Bonsoir toutes et tous !  :)

 

Nouvel essai ce jour, Safranine - Bleu Astra.

 

Décidément, ce n'est pas bon.

 

Voici ce que j'ai fait:

 

- Dakin 30 min

- Bon rinçage

- Acide acétique 50% 3 min

- Safranine 1/20 2 min

C'était trop foncé, bain alcool chlorhydrique 30/4, c'était insuffisant, j'ai fait un 2 em bain 30/4

La coupe s'est quelque peu ratatinée.

- Bon rinçage.

- Bleu Astra 1/10 2 min

- Rinçage

- montage glycérine.

 

Voici les images.

 

essai-safranine-2.JPG

 

 

eessai-safranine-2-2.JPG

 

Amitiés

Patrick


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#3 Dominique.

Dominique.

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Posté 25 novembre 2022 - 11:47

Bonsoir Patrik

 

      Pourrais-  tu  refaire  la préparation  

Fixation  avec le mélange

Alcool éthylique   70%     90 cc

Acide acétique  glacial ( c'est  son nom )  5 cc

Formaldehyde 40%    5 cc  ( si tu n' en as pas   n' en mets pas  et utilise  seulement alcool éthylique + acide acetique)

 

  Donc   l acide  acétique est utilisé  à 5 %  (pas 50 )

 

et  ne laisser le bleu astra  que 20 secondes

 

    j' ai refais une préparation  selon le protocole suivant

 

Coupe  au Ranvier

Fixation  8 minutes

Rinçage

Dakin 8 minutes

Rinçage

Safranine  à 1%   3 minutes

Décoloration avec   bain d’alcool acide  et contrôle de la décoloration ( a renouveler si nécessaire )

Rinçage  3 fois

Solution d’alun de potasse  4 minutes

Rinçage 3 fois

Astra bleu  20 secondes

Rinçage  3 fois    et ablation de l’eau  du verre de montre

Alcool  isopropylique 99 %      1 minute pour la  déshydratation  ( ou alcool éthylique )

 Transfert  de l’échantillon  sur la lame  - inclinaison de la lame 

Xylène  1 à 2 gtt   sur l’échantillon   inclinaison de la lame pour enlever l excèdent

Montage    au Baume

 

Tige  de  géranium :

1.patrick texte prep.jpg

quelques  images  de la technique de préparation

1.patrick texte  labo.jpg

même avec 20 secondes   tu  vois  que  c'est  déjà  de trop  et que le bleu  domine le  rouge.

 

On va  y arriver

    Amicalement

                 Dominique

 

 


Modifié par Dominique., 25 novembre 2022 - 11:51 .

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#4 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 26 novembre 2022 - 02:12

Bonjour Dominique et merci pour ton aide.

 

Quel est le but de la fixation préalable ?

Dans les protocoles que je vois, c'est directement Dakin, rinçage, puis eau acétique, puis coloration.

 

J'ai un flacon de AFA de chez BEGENAT, c'est marqué acide acétique 4%, formol 7%

J'ai utilisé ce flacon.

 

Donc voici ce que j'ai fait ce soir :

 

- AFA 8 min

- Rinçage

- Dakin 8min

- Rinçage

- Eau acétique 5% 2 min

- Safranine diluée 1/40 gouttes 3 min

- Rinçage

- Bleu Astra dilué 1/10 gouttes 30 sec

- Rinçage

Montage glycérine

 

Voici ce que cela donne :

 

Vue d'ensemble, je l'ai faite avec l'outil mosaïque de Toupview, pas eu le courage d'utiliser ICE.

Donc quelques défauts.

safranine-test-3.JPG

 

Objectif 4x :

safranine-test-3-1.JPG

 

Amitiés

Patrick


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#5 Patrick-06

Patrick-06

    Procaryote

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Posté 26 novembre 2022 - 07:17

Ah, j'ai trouvé pour la fixation :

 

 

La fixation est l'étape la plus importante du processus de préparation histologique. Elle doit avoir lieu le plus rapidement possible après le prélèvement des tissus pour éviter l'auto-destruction du tissu (autolyse). La fixation permet de stabiliser les protéines tout en préservant l'aspect structural du tissu

 

Mais pourquoi la plupart des protocoles histologiques végétaux ne la prévoient-ils pas ?

 

Donc : Fixation, rinçage, hypochlorite pour vider les cellules, rinçage, eau acétique pour éliminer les résidus d'hypochlorite et favoriser la coloration, coloration.

 

Amitiés

Patrick


Modifié par Patrick-06, 26 novembre 2022 - 07:18 .

  • 0

#6 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 26 novembre 2022 - 08:57

Bonjour Patrick, tous,

Ah, j'ai trouvé pour la fixation :

Non !

 

Excuses moi, d'être aussi agressif dans ma réponse, mais ceci est faux.

Tu te poses une fausse question , ou plutôt tu choisis dans l un QCM  inadapté à ton problème, la mauvaise réponse.

 

Pour comprendre, il faut que je m'expliques et cela peut être assez dense.

Donc, à tout de suite. (J'ai quelques trucs à faire.)

 

Amicalement.

 

 

 


  • 0

#7 Dominique.

Dominique.

    Anthropoïde

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Posté 26 novembre 2022 - 09:59

Bonjour   

 

   Ton nouveau  protocole  donne  des  bons résultats .

 

   Ce matin  j’ ai aussi  modifié le  protocole  sur  2 points

 

Safranine à 1 %     dilution   1 gtt   d’eau  + 1gtt de Safranine  2 minutes

Bleu astra     dilution       5 gtt d’eau  +  1 gtt de Bleu Astra      40 secondes

 

Sinon  le reste du protocole  est identique

1.patrick texte 3.jpg

1.patrick texte 4.jpg

 

On constate  que l’ équilibre  des  couleurs  est meilleur    avec  les  nouvelles  dilutions  et les  nouveaux temps .

Par contre   il  faut  beaucoup de coupes   pour  en avoir  1 à 2 présentables  et ce  sont  toujours les plus  fines  qui se  colorent le mieux   - donc  le travail   au microtome est fondamental  -

 

On doit  pouvoir  faire mieux  les couleurs  sont encore trop soutenues.

 

 Après  le résultat   dépend  aussi  des colorants  utilisés

 

Amicalement

         Dominique


Modifié par Dominique., 26 novembre 2022 - 10:03 .

  • 0

#8 Tryphon T

Tryphon T

    oooOooo

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Posté 26 novembre 2022 - 10:19

Me voilà donc revenu,

 

La microscopie couvre un large champ de disciplines.

Si l'on recherche des "colorants pour microscopie" on trouvera des choses bien différentes car elles s'appliquent à des domaines différents.

 

Exemple: je ne vais pas utiliser le May-Grunwald-Giemsa pour colorer des pelures d'oignons.

C'est totalement illogique , et coûteux.

Cependant, si par curiosité, vous voulez essayer, c'est une démarche compréhensible, qui peut faire partie de l'esprit de curiosité.

Par contre si vous voulez débuter dans les colorations ; COMMENCEZ PAR LE DEBUT, c'est à dire entrainez vous sur des techniques classiques certifiées, pas sur des "bricolages" trouvés n'importe où.

 

Quoi qu'il en soit, les techniques de colorations sont si nombreuses que la methode empirique n'est pas une bonne école.

Aucune recette, aucun protocole, aucun algorithme de dispense de réfléchir!

 

Qu'est ce qu'il faut dire au sujet de la fixation?

Et d'abord, il faut se poser la question : pourquoi fixer?

 

La chair animale est composée de cellules animales qui , à la milli seconde où elles ont perdues leur vie, commencent à se décomposer sous l'action des milliers d'enzymes qu'elles comportent.

Si on veut examiner au microscope des cellules animales, il faut le plus rapidement possible (maximum quelques secondes) les plonger dans un fixateur adéquat.

Parallèlement à la lyse enzymatique, la prolifération bactérienne dégrade totalement la cellule.

 

Les végétaux ne sont pas soumis à ce type de phénomène de décomposition, car la rigidité de la plante est due à leur paroi cellulosique rigide et à leur organisation en "nid d'abeille".

D'autre part, l'étude microscopique des végétaux est orientée vers la mise en évidence des différentes structures de ces membranes organisée en tissus  et de composition différentes. 

On parle de xylème, ou de phloème par exemple.

Les colorations de parties de végétaux est donc orientée sur la détermination de structures membranaires et dans ce cas, le contenu cellulaire intramembranaire, n'est pas utile et même gênant.

 

Si dans le cas d'histologie animale, il est urgent de fixer, dans le cas de l'histologie végétale, il faut en premier  vider le contenu cellulaire et ne conserver que les membranes! (Javel)

Alors  se pose la question de fixer  ensuite ou pas les membranes.

 

Voir ce lien :   https://www.microsco...e-Fixations.htm

 

 

Amicalement.


  • 0

#9 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 26 novembre 2022 - 12:11

Merci pour ces précisions Tryphon !   ;)

Merci Dominique, je vais refaire cet après midi. Je m'acharne !  :lol:

 

Amitiés

Patrick


  • 0

#10 Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

Jean-Luc Bethmont (Picroformol)

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Posté 26 novembre 2022 - 06:00

Bonjour Patrick,

 

  Je trouve que tu a bien progressé en peu de temps.

Les coupes histologiques que nous présente Dominique sont ( je pense) le fruit d' une grande expérience et de patience, ce qui peux être trompeur en les regardant et en se disant "ça a l' air facile de faire la même chose" il n' en est rien.

 

Pour arriver à un résultat correct il faut que chaque étape soit bien effectuée, chaque défaut de chaque étape se cumule et à la fin ce n' est pas top !

 

Je suis d' accord sur le fait que tes coupes sont encore un peu épaisses.

Personnellement je m' entainerais avec des carottes, navets ou autre légumes que l' on peut tailler facilement à la taille du microtome (comme le dit Dominique il faut en faire une série pour ne sélectionner que les 2 plus fines par exemple) pour acquérir le bon geste (angle de coupe, mouvement de la lame etc....)

       Autre point la qualité de l' eau utilisée au cours des rinçages ou de la préparation des réactifs a son

importance: le pH  de l' eau (plus ou moins acide ou basique) ainsi que la présence de certains ions peut influencer la coloration.

 

Bon courage,

JL

 


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#11 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 28 novembre 2022 - 09:30

Coucou toutes, tous !  :)

 

Merci Jean-Luc pour tes encouragements et tes précisions.

Pour l'eau, j'utilise l'eau déminéralisée pour les rinçages et l'eau distillée pour diluer les colorants et autres produits.

 

J'ai passé ces deux jours à multiplier les essais avec Crassula ovata, en vain…

 

 

Puis j'ai essayé avec une autre plante dont je ne connais pas le nom.

Là, cela semble meilleur. Je me demande si cette Crassula ovata n'est pas plus difficile que d'autres, d'agissant d'une plante grasse.

Elle a peut-être du sang d'alien !  :lol:

Je vais continuer avec d'autres types de plantes.

 

Voici ce que cela donne avec cet essai :

Pour les bulles, rien à faire, j'ai utilisé du liquide vaisselle, tapoté l'échantillon avec un pinceau, les bulles sont incrustées.

PS. J'ai essayé d'envoyer une image .webp, cela est interdit. Dommage, ce format se généralise et est bien moins lourd que le jpg...

Mosaïque2.JPG

 

Amitiés

Patrick


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#12 Tryphon T

Tryphon T

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Posté 28 novembre 2022 - 11:14

Bonjour Patrick,

 

Je ne met pas en cause tes efforts et ta persévérance, au contraire, je suis admiratif pour ta patience !

 

Ce qui me gêne, c'est ton protocole !

 

Donc voici ce que j'ai fait ce soir :

 

- AFA 8 min

- Rinçage

- Dakin 8min

- Rinçage

- Eau acétique 5% 2 min

- Safranine diluée 1/40 gouttes 3 min

- Rinçage

- Bleu Astra dilué 1/10 gouttes 30 sec

- Rinçage

Montage glycérine

 

Dans les coupes végétales, ce qui compte, ce sont les membranes et non le contenu cellulaire qui est un handicap.

On élimine donc le contenu cellulaire (Javel : le Dakin, c'est du javel) et éventuellement après rinçage on fixe, mais à mon avis cela ne sert à rien de fixer.

 

L'AFA , c'est un fixateur ! 

Donc commencer à fixer le contenu cellulaire 8mn avant  de vouloir l'éliminer au javel , n'est pas du tout logique.

 

***

 

 

 

Amicalement.


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#13 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 28 novembre 2022 - 11:22

Bonjour et merci Tryphon,

 

Mais pour mes derniers essais, j'ai supprimé le fixateur.  ;)

 

Amitiés

Patrick


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#14 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 28 novembre 2022 - 02:39

Bonjour,

 

Encore quelques expériences, mais, cette fois, au camino-vert de Mirande.

 

J'observe que sur le Carssula ovata, il n'y a aucune différenciation du xylème et du phloème.

Par contre, sur les autres plantes, cette différentiation est parfaitement présente.

 

Ceci pour dire que je m'acharne depuis plusieurs jours à colorer une coupe de tige de Crassula et qu'il y a manifestement un souci avec cette plante grasse, que ce soit au carmino vert ou à la safranine....

Quelle perte de temps !

 

Exemple Crassula au carmino vert :

Mosaïque3.JPG

 

 

Exemple autre plante au carmino vert :

m-4.JPG

Amitiés

Patrick

 

 

 

 


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#15 Dominique.

Dominique.

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Posté 28 novembre 2022 - 05:32

Bonsoir Patrick

 Ta dernière  préparation est de  bonne qualité –   tu as eu raison de changer de plante ( toutes les plantes à parenchyme riche en eau  sont très  difficile à préparer)

 

 

 De mon côté  durant le weekend    j’ai  expérimenté  les dilutions ; le  meilleur  résultat  est obtenu avec le protocole suivant.

Coupe de  tige de géranium

Fixation  Afa  8 minutes        ( le  but  n’ est pas le même  qu’ en  histologie  animale  ( nos anciens  avaient  constaté   que  ce mélange  permet  une meilleur  fixation des  couleurs   ; certains  disent  que cela  est dû  à l’acide acétique  - d’ autre  que cela  est dû au formol).

Rinçage

Dakin    8 minutes

Rinçage

Safranine    dilution  3 gtt safranine   +   6 gtt  d’eau    3 minutes

Rinçage

Décoloration à l’alcool chlorhydrique    jusqu’ à obtenir  une teinte  rose

Alun de potasse    4 minutes

Rinçage

Astra bleu  dilution   2 gtt    de  Bleu  + 12 gtt  d’eau    1 minute   ( il faut surveiller  à la  bino  la fixation du  bleu  et arrêter dès la couleur  désirée obtenue ).

Déshydratation    Alcool isopropylique 100  1 minute

Montage  sur une lame  - drainage de l’ alcool en  penchant la lame .

Xylène   juste une  goutte   - et l’évacuer en penchant la lame.

Montage  au Baume    -(les montages  à la gélatine  ont très souvent  des bulles ce qui  est beaucoup plus rare après un  bain d’alcool).

 

Ci-dessous  2 résultats

La première coupe  n’est pas  totalement homogène ( d’où la surcoloration  à droite ) de  plus la décoloration a été trop courte .

La seconde   me semble satisfaisante.

X 40 panorama   composé par ICE.

1.patrick texte 5.jpg

1. patrick texte 6.jpg

 

Avec  ta  dernière  coupe   tu  sembles  désormais  bien contrôler la coloration  - Pour  chaque  couleur   il y a  toujours une période de titration   qui  est individuelle   en raison   de la provenance  du colorant  et de son âge .

 

Félicitation  pour  ta persévérance .

 

                 Amicalement

                                              Dominique


Modifié par Dominique., 28 novembre 2022 - 10:31 .

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#16 Patrick-06

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Posté 28 novembre 2022 - 05:40

Bonsoir et merci Dominique,

 

Je vais suivre ton protocole sur une nouvelle plante.  ;)

 

Amitiés

Patrick


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#17 Dominique.

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Posté 28 novembre 2022 - 10:37

Bonsoir  Patrick

 

     Pour les quelques  bulles d ' air  qui  restent il est possible de les  enlever  en utilisant le logiciel   de traitement  d' image GIMP gratuit

 

 Bonne nuit

                   Dominique.


  • 0

#18 Patrick-06

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Posté 29 novembre 2022 - 09:44

Bonsoir toutes et tous !  :)

 

Voici un essai avec une nouvelle plante : Le Maceron

 

 

 

Le maceron (Smyrnium olusatrum) est une plante herbacée bisannuelle de la famille des Apiacées (Ombellifères). Ce « légume oublié » est parfois encore cultivée comme plante potagère pour ses feuilles et ses jeunes pousses consommées comme légume ou utilisées pour aromatiser les mets. Il est aussi apprécié pour sa racine tubérisée et ses graines séchées.

Source Wikipédia 

 

Dominique, j'ai suivi ton protocole.

Qu'en penses-tu ?

 

Je n'ai peut-être pas suffisamment régressé à l'alcool chlorhydrique ?

Le rose dégorgeait encore dans le montage à la glycérine…

 

Vue d'ensemble réalisée avec ICE

Maceron2.JPG

 

Amitiés

Patrick


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#19 Dominique.

Dominique.

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Posté 29 novembre 2022 - 10:11

Bonsoir  Patrick

 

    C' est presque   bien réussi .

 

    Ta coupe  est  bien  homogène - par contre  comme  tu le dis  la décoloration n' est  pas  suffisante   ;  tu n' as pas du attendre que le rose soit bien installé  sur la totalité de la coupe   Mais  tu es presque  arrivé  au bout du chemin

    Quand le bain dans l' alcool acide  est devenu  trop rose   et que de ce fait tu ne peux  plus contrôler la décoloration   , il ne  faut pas  hésiter  à faire un  second  bain dans un alcool acide neuf.

    Par contre le bleu est correct  ni trop  ni trop peu.

    et  pas  de bulle à l' horizon .....

   Amicalement

        Dominique.


Modifié par Dominique., 29 novembre 2022 - 10:16 .

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#20 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 29 novembre 2022 - 10:21

Merci Dominique,

 

Je vais refaire en décolorant bien et si c'est bon, je monterai au baume.

 

Amitiés

Patrick


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#21 Patrick-06

Patrick-06

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Posté 01 décembre 2022 - 11:38

Bonjour !  :)

 

Nouvel essai, cette fois-ci, avec une tige de laurier rose.

 

La tige est dure à couper, j'ai fait aussi la tige terminale qui est différente.

 

Pour la décoloration de la safranine, c'est particulièrement long, j'ai laissé 30 min dans 2 bains, jusqu'à ce que les motifs rouges se détachent bien du reste.

J'utilise de l'alcool isopropylique, je vois dans le SEGY qu'il préconise l'Éthanol. Cela fait-il une différence ?

 

Voici le résultat.

 

Partie la plus dure de la tige, difficile à couper, donc un peu épaisse.

laurier-rose-2.JPG

 

 

Partie terminale, il y a sans doute trop de bleu.

laurier-rose-1.JPG

 

 

Amitiés

Patrick

 


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#22 Dominique.

Dominique.

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Posté 01 décembre 2022 - 02:42

Bonjour Patrick

 

   Tes deux coupes sont  bonnes   mais  il manque de la lumière   -  en reprenant ces photos  avec GIMP   tu devrais  les améliorer  de façon notable  en utilisant  l' outil  couleur   - courbe  -  ( tu augmentes la lumière  et le rouge )

 

   il faut remarquer  que l' utilisation de la Safranine  n' est pas  des plus faciles

 

  30 minutes  c'est long: ta safranine  doit être encore  trop  concentrée ou le temps  de coloration  utilisé trop long.

 

  les deux alcools  donnent  un  résultat semblable  -

 

  Amicalement

                Dominique


Modifié par Dominique., 01 décembre 2022 - 02:43 .

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