Bulles - préparation botanique - recherche de solutions
Au cours d’ un de ses messages Patrick nous avait proposé d’utiliser le Fotonal pour limiter le développement de bulles lors des préparations microscopiques.
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Le nonylphénol et ses dérivés éthoxylés du nonylphénol (NP-NPE) sont utilisés depuis plus de 40 ans comme détergents, émulsifiants, agents de mouillage et agents dispersants.
Jusque-là pour éviter les bulles on faisait confiance à
--La finesse de la coupe ( qui est le point le plus important de la préparation.)
--L’adjonction d’un peu de liquide vaisselle dans l’eau de rinçage.
--La déshydratation des coupes à l’alcool.
--Le tapotement avec un pinceau de l’échantillon dans l’alcool pour détacher les bulles.
--Le Montage dans le baume du canada ou ses dérivés comme l’ Euparal .
--Le passage de la lame montée à 40 °c 24 heures avec sur la lame un petit poids types boulons.
Le Fotonal a été ici utilisé de 2 façons :
en solution aqueuse à 1%
en solution alcoolique éthylique 99 % à 1 %
(le fabriquant propose de l’utiliser en solution à 0,5% ce qui se révèle insuffisant)
Son utilisation a mis en évidence une nette tendance de la solution alcoolique ( ce qui est moins net avec la solution aqueuse) à la décoloration de la Safranine et son absence d’action sur le Bleu Astra .
Cela conduit à proposer la séquence Bleu Astra - Safranine (et non l’inverse)
D’où le protocole suivant
Bain dans le Dakin 3 heures
Rinçage : 3 fois eau déminéralisée.
Fixation avec le mélange Alcool – acide acétique – formol ( AFA ) 10 minutes
Rinçage : 3 fois avec eau déminéralisée.
Bain dans solution d’Alun de potasse 5% 4 minutes.
Rinçage 3 fois (solution aqueuse de fotonal 1%).
Bleu Astra dilution 2 gtt + 6 gtt eau 3 minutes.
Rinçage : 3 fois (solution aqueuse de fotonal 1%).
Safranine dilution 3 gtt + 6 gtt d’eau 3 minutes.
Rinçage : 3 fois (solution aqueuse de fotonal 1%).
Puis
Déshydratation dans solution alcoolique de fotonal1%.
Bien surveiller la décoloration et arréter une fois le résultat obtenu en remplaçant la solution alcoolique par de l’ alcool 99 % .
( il est possible que la décoloration ne soit pas suffisante -on peut encore à ce stade utiliser un mélange Alcool + Acide chlorydrique ) dans ce cas on termine par un rinçage supplémentaire Rinçage : 3 fois (solution alcoolique de fotonal 1%).
Passage de Xyléne .
Montage au Baume (ici de type Euparal ) . Passage à l’étuve) à 40°c 24 h.
********Exemple *************
La coloration est faite sur une coupe de Sedum Lucidum.
Cette plante succulente est de montage difficile en particulier pour réaliser un montage sans bulle.
L’expérience faite selon le protocole développé permet de réaliser des images quasiment sans bulle.
A – zone vasculaire
A – zone épidermique
B – collenchyme
C – parenchyme médullaire
Le parenchyme médullaire est parcouru par un réseau vasculaire fait de vaisseaux disposés en faisceaux suivant la direction de la racine de la feuille vers son apex.
Coupe de la tige
Cette photo montre la manière dont la feuille se fixe sur la tige
Coupe du bord de la tige.
Image de la zone corticale avec sa zone épidermique et une couche de cellules du collenchyme .
Les vaisseaux de la tige forment un large faisceaux qui se dirige depuis l’ axe central de la tige vers la zone d’insertion de la feuille
Les conclusions sont
--La première constatation lors de cette préparation est qu’une fois arrivée au stade de la déshydratation la quantité de bulles est très modeste.
--La seconde constatation est que ces bulles se détachent très facilement sous l’ effet du tapotement dans l’ alcool à la phase déshydratation.
--Les quelques bulles qui restent se dissolvent dans l’ Euparal ( ou le Baume ).
--Il est constaté en parallèle une répartition des couleurs beaucoup plus homogène qu’ en l’absence de Fotonal ..
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Le Fotonal est donc intéressant à ajouter à nos protocoles ( d’ autant que ce produit se trouve facilement à petit prix ) et n’ alourdit pas vraiment les manipulations .
Merci Patrick
Dominique.
