comment faire des préparations qui se conservent - montage des lames

[Jean Marie Cavanihac]

 

MONTAGE DES LAMES J.M. CAVANIHAC

 

	Dans les observation microscopiques que nous faisons, entre pour une large part le hasard : certains organismes n'existent qu'en un seul spécimen dans notre prélèvement et nous resterons peut être des années sans en retrouver un autre... Que faire pour conserver une trace de ces observations uniques ? La première idée qui nous vient est de faire photos sur photos, avec des grossissements différents, voire réaliser une mosaïque d'image pour obtenir une vue globale du sujet . Mais est ce suffisant ?? Par exemple certaines espèces de copépodes ne se différencient que par la forme des appendices servant à la nage. Si ceux ci ne sont pas nets ou sont cachés dans le plan de prise de vue il sera impossible à posteriori d'identifier l'organisme uniquement sur photo. D'ou l'alternative, utilisée depuis des décennies, peut être aussi parce que la photo était trop chère, de conserver physiquement les objets en réalisant leur montage sur lame. Cette solution permet à tout moment de revoir le spécimen, de rechercher un détail qui aurait échappé à la photo, d'utiliser d'autres techniques d'observation : lumière polarisée, contraste de phase, DIC,... le jour ou nous aurons à notre disposition des microscopes plus sophistiqués...
	Première étape : Avant de placer définitivement le sujet entre lame et couvre objet (définitivement, car cet assemblage est difficilement démontable et entraîne en tous cas la perte de l'objet), il faut qu'il soit apte à se conserver le plus longtemps possible: pour cela la première opération est de le fixer (c'est le terme utilisé) en l'imprégnant de substances qui stoppent les processus de dégradation en général par dénaturation des protéines. L'agent fixant le plus connu est le formol, mais l'alcool peut être utile aussi (avec de moins bons résultats), de même que l'acide acétique . On aborde ici un des casses têtes du microscopiste amateur qui est de se procurer en faible volume (et faible coût !) ce type de produit. Les distributeurs de produits chimiques vous fourniront aisément 1 litre de formol ultra pur pour 25 € mais qu'en ferez vous, sachant qu'il polymérise au dessous de 17 ° avec le temps et devient inutilisable. Donc: formol en dilution de 4 à 10 % . Pour se dépanner : un produit désinfectant pour aquarium en vente dans les animaleries (évite les points blancs sur les poissons...) contient 4% de formol dans une de ses versions et 10 % dans une autre plus quelques milligrammes de désinfectant et un colorant. La concentration devrait convenir, mais j'avoue ne pas avoir trop de recul quant à la conservation. Un fixateur 'universel' est le picro formol de BOUIN qui est un mélange de 25 % formol, 70 % acide picrique et 5% acide acétique (en vente dans magasin spécialisé en microscopie ) Un classique : le Lactophénol mais en plus de l'acide lactique il contient du phénol qui est toxique. Idem magasin spécialisé. NB: le formol n'est pas anodin pour la santé et il faut éviter d'en respirer les vapeurs. Toutes les adjonctions de produits se font directement sur la lame afin d'éviter de manipuler des échantillons fragiles. Personnellement j'utilise le Bouin. Mais à défaut un mélange de 20 ml de vinaigre, 75 ml d'alcool à 90° (alcool pour désinfection d'instruments : pas pour soigner les plaies !) et 5 ml de glycérine est un conservateur acceptable utilisable avec des temps de fixation plus longs (une 1/2 heure à 1 heure ) mais non toxique.
	2° étape : LAVAGE : eau distillée ou déminéralisée : très important surtout après utilisation du formol : tout résidu va rendre l'objet cassant à long terme et va aussi le décolorer. Si on souhaite colorer , c'est le moment. 2° étape et demie : facultative : Coloration : la 'bonne' coloration est celle qui permet de colorer spécifiquement certains tissus (et pas les autres) pour mettre en évidence des structures parfois trop transparentes (ex: noyaux cellulaires...). Là encore casse tête : mais deux colorants au moins sont facile à trouver : éosine (en grandes surfaces et parfois en dosettes très pratiques) et bleu de méthylène (pharmacies). A défaut on peut essayer les colorant liquide alimentaires (voir rayon préparation pour gâteaux !). Sans trop entrer dans les détails il y a deux modes de coloration : coloration progressive et régressive. Dans le premier cas on plonge l'objet dans le colorant et on surveille la coloration : on stoppe en rinçant quand la densité souhaité est obtenue. Dans la méthode régressive on sur- colore et on plonge ensuite dans un bain décolorant en surveillant cette fois la décoloration. Par exemple pour décolorer avec l'éosine utiliser 100 ml d'alcool à 70 ° dans lequel on a mis 1 ml d'acide chlorhydrique. Toujours bien rincer ensuite.
	3° étape choix du milieu de montage: la suite du processus va dépendre du milieu de montage : il y en a de deux types : milieux aqueux et résines . La résine la plus connue est le Baume du Canada (résine naturelle d'un pin) : MAIS les objets doivent être parfaitement déshydratés par passages prolongés dans plusieurs bains d'alcool absolu puis du xylène (toxique ++) . La conservation est parfaite et les anciennes lames étaient montées ainsi. Ce traitement est un peu agressif pour de petits objets qui ne supportent pas bien la déshydratation : si celle ci n'est pas parfaite la préparation va se troubler sous le couvre objet et devenir opaque.
	A notre niveau et tout en acceptant une durée de conservation bien moins longue (4 - 5 ans au moins quand même) il existe une technique très simple, pas chère, pratiquement applicable à tous les objets, non toxique et sous certaines conditions permettant de démonter les lames . C'est la gélatine glycérinée (GG): encore une vieille recette, mais qui vous plaira car vous pouvez la faire vous même avec de la gélatine alimentaire en feuilles au rayon pâtisserie (encore !) des grandes surfaces (ou à partir de suppositoires à la glycérine ...mais je vois d'ici votre tête en allant en acheter à la pharmacie : rassurez vous, ils existent aussi en modèle 'enfant' et vous pourrez toujours prétexter que c'est votre petit dernier qui a des difficultés à évacuer...)
	Pour les suppos : très simple : faire fondre au bain marie et rajouter une quantité égale de glycérine, Laisser le produit se solidifier dans un flacon à large ouverture
	Avec les feuilles : Faire tremper 2 grammes de feuilles de gélatine dans 10 ml d 'eau pendant 2 heures. Faire chauffer au bain marie dans le flacon définitif (de préférence à large goulot, contenance 30 à 50 ml) jusqu'à ce que la gélatine soit fondue: ajouter alors 12 ml de glycérine et remuer longuement pour bien mélanger : laisser encore 5 minutes puis laisser refroidir. Ne pas laisser bouillir !. La gélatine se solidifie mais le mélange reste souple. Il est ensuite possible d 'en retirer des petits morceaux avec une pince à épiler. Ceux ci fondent vers 50 à 60 ° C ce qui permet d 'y inclure les objets sans trop les chauffer. Il faut au préalable imprégner les objets sur la lame avec du liquide glycériné et laisser évaporer un peu : les objets doivent être justes humides . Si nécessaire retirer l'excédent avec un coin de mouchoir en papier. On peut aussi poser quelques fragments de GG (pas plus gros qu'une lentille (pas optique mais le légume!) a proximité de l'objet et laisser fondre : la GG imprégnant alors l'objet.
	Comment chauffer ? le plus simple est quelques secondes au micro onde: la gélatine ne doit surtout pas bouillir : faites quelques essais préalables ! S'il y a des amateurs, je décrirais un petit accessoire chauffant alimenté en base tension permettant de fondre la gélatine sur votre bureau lui même. Il y a une petite astuce pour éviter d'emprisonner les bulles, c'est d'appuyer la lamelle sur une aiguille avec l'autre côté trempant dans la gélatine fondue , puis de baisser l'aiguille tout en la retirant doucement comme indiqué ci dessous.
	Après cela vous pouvez observer au microscope et voir si le sujet n'a pas bougé, s'il n'y a pas de grosses bulles d'air (< à 1 mm) (sinon la dilatation de celui ci finira par décoller la lamelle) . Si c'est vraiment raté vous n'aurez pas gaspillé lame et lamelle : plongez le tout dans un verre d'eau très chaude et la GG fondra libérant ces deux éléments ! S'il n'y a pas assez de gélatine c'est rattrapable, : poser un petit fragment contre le bord du couvre objet où se trouve le manque et remettre à chauffer doucement : en fondant la GG passera sous le couvre objet par capillarité . Par contre si tout vous paraît bon, lorsque la gélatine a durci, bien nettoyer avec une vieille brosse à dents sous un filet d'eau bien froide les excédents de gélatine, laisser bien sécher puis passer une couche de vernis (à ongle incolore ou... à paillettes si vous voulez faire 'Disco' ! : le vieux vernis un peu épais que votre copine ou épouse ne peux plus utiliser est parfait ) ou de peinture à maquette (séchage rapide) à cheval sur le bord du couvre objet et la lame pour éviter toute évaporation. N'oubliez pas d'identifier le sujet sur l'étiquette de la lame, date, et mode de préparation. Pour trois francs six sous, avec du carton fort vous pouvez vous constituer des boites de rangement comme ci dessous:
	Je vous entends déjà demander : et le montage des protozoaires ? : il est extrêmement difficile car ils se contractent ou explosent lors de la fixation ou du montage. Vous pouvez essayer de faire des frottis en mélangeant très peu de NIGROSINE ou à défaut d'encre de chine à l'eau ou ils se trouvent sur la lame étaler, et sécher TRES rapidement. Mais çà marche un coup sur dix.