Dominique.

Cette année le printemps a été particulièrement froid et humide. Le pêcher du jardin a développé ses fleurs puis ses feuilles mais rapidement les feuilles se sont mises à se déformer Feuilles saines Feuilles déformées au mois de Mai La feuille prend une couleur rouge Feuilles au mois de Juin La phytosynthése est arrêtée - L’examen de la feuille encore saine Coupe de feuille saine de 10µm au microtome - après inclusion dans la paraffine – Coloration : vert Etzold - 1 -- cuticule (couche imperméable) 2 -- parenchyme chlorophyllien palissadique 3 -- parenchyme chlorophyllien lacuneux 4 -- épiderme inférieur 5 – épiderme supérieur Coupe de feuille saine à la main avec un Ranvier Coloration vert Etzold (on constate que le colorant ne réagit pas de la même manière en fonction de la technique de préparation) L’examen de la feuille déformée Coupe de feuille déformée au microtome 10 µm -après inclusion dans la paraffine Ce qui frappe dans la photo ci – dessous c’est la désorganisation de la couche cellulaire supérieure c’est à dire la couche palissadique ( 1 ) - (qui a en fait disparu ) - toute la zone spécialisée dans la photosynthèse a été détériorée - la chlorophylle disparaît

Classification de Pénicillium 1. Fungi 2. Ascomycota 3. Pezizomycotina 4. Eurotiomycetes 5. Eurotiomycetidae 6. Eurotiales 7. Trichocomaceae 8. Penicillium Références Internet du Pénicillium camembertii dans la fabrication des fromages http://biosol.esitpa.org/liens/fromage_2003/camenberti.htm Description complète sur Myco bank avec photos http://www.mycobank.org/Biolomics.aspx?Table=Mycobank&MycoBankNr_=175171 Milieu de Czapek : NaNO3 :2g / KH2PO4 : 1 g / MgSO4 -7 H20 :0,5g / Kcl : 0,5g / FeSO4-7H2O :0 ,01 g Saccharose 30 g / Agar : 20 g Eau distillée 1000ml - Stérilisation 110 °C pendant 20 minutes - ajouter ensuite CuSO4 : 0,005 et ZnSO4 O, O1 ( ce milieu favorise le développement de Penicillium – Aspergillus – Fusarium et son acidité élimine les bactéries ) Pour la petite histoire Le brie serait la plus ancienne des pâtes molles. Le camembert compte à peine plus de deux siècles. Il a été inventé sous la Révolution par une fermière normande, Marie Harel. Celle-ci apprit d'un prêtre réfractaire, le secret de fabrication des fromages briards. La recette fut reprise par sa fille qui s'établit à Camembert. A la fin du siècle dernier, lors d'un déplacement dans la région, Napoléon III découvrit avec délices le fromage qu'il baptisa "Camembert". Puis, un certain Ridel eut l'idée de la boîte en bois qui allait lui permettre de voyager, de conquérir la France et le monde. L’énigme : Le prêtre a t il donné à Marie Harel simplement le secret de fabrication ou lui a t il apporté aussi le milieu d’ensemencement contenant les deux moisissures Geotricum et Pénicillium- Si oui : Dans ce cas d’ où vient la différence entre les deux fromages - Si non : par quel mystère les deux moisissures blanches se sont telles trouvées ensemble sur un pot de lait caillé dans une cave normande ? •Question : Le Penicillium Camembertii existe t il sur le Brie ?

Pénicillium Camembertii Résumé de l histoire : Parti d’un morceau de croûte de camembert au lait crû à la recherche de la moisissure « star » de ce fromage – le pénicillium - je n ‘ai pas eu le résultat espéré - par contre ce parcours a mis en évidence que la moisissure la plus fréquente sur le camembert est en réalité le Geotrichum album - Les tentatives de mise en évidence du Penicillium ont ensuite consisté à modifier les paramètres du milieu de culture – pH - température - on a ainsi découvert des moisissures commensales - éventuellement pathogène - comme Rhizopus et Moniliella Dernier épisode ( on y arrive enfin ) Tout le problème a été d’éliminer le Geotrichum extrêmement prolifique et très envahissant D’où le protocole suivant – trouvé après bien des déboires - Première étape -( développement des moisissures –milieu N° 1 ) - Appauvrissement du milieu PAG par passage au congélateur - en effet la décongélation lui fait perdre beaucoup d’eau – donc crée un appauvrissement en éléments nutritifs - (ablation de cette eau ) - Baisse de la température ambiante à 5 degrés (celui du réfrigérateur ) - pH 7 non modifié Dans ces conditions le Penicillium a été gagnant, lui dont l ‘ amplitude de tolérance des températures va de 5 degrés à 20 degrés et dont les besoins nutritifs sont plus faibles Il s’est développé lentement - au-dessus puis autour du petit morceau de croûte de fromage mis en culture - un thalle d’un blanc lumineux Deuxième étape ( Sélection N° 2 ) ¨ Pour être certain de bien isolé la moisissure on fait un repiquage sur le milieu artificiel de Czapek -en sélectionnant les spores sous binoculaire - Au bout de 15 jours on a obtenu la culture pure : - la croissance se confirme être lente même à température ambiante ( 18 °C ) (la boite de Pétri à le même aspect que le milieu N°1) Images microscopiques du Pénicillium en zone aérienne Dans la forme d’un Pénicille jeune (–X600 –Fond clair –Bleu coton lactophenol-) Dans la forme d’un Pénicille plus âgé ( X 600 – Fond clair – Rouge Congo - ) L ‘étude de la partie immergée du milieu N° 1. ;Dans ce milieu de culture si Le Pénicillium a emporté le développement, le Geotrichum est pourtant bien présent -(cela ne se voit pas sur la photo de la boite de Pétri mais sur certains endroits il y a des plages de Geotrichum -ce qui a justifié la seconde culture ) Présence des deux formes de spores des deux moisissures dans la zone immergée Conclusion : La difficulté de la mise en évidence de cette moisissure a été liée au fait qu je suis parti d’un fromage commercialisé - c’est à dire salé - Or le salage bloque en grande partie le développement du Pénicillium – La difficulté a aussi tenu au caractère très envahissant du Geotrichum qui abouti à la disparition de toute trace de Penicillum Camembertii sur la croûte ( en dehors de spores à l ‘état végétatif que l’on a réussi à réactiver dans cette expérience ) Cela nous a surtout permis de constater que contrairement à ce qui peut être lu - la couleur blanche du camembert est liée au développement de Geotricum album et pas à celui de Pénicillium camembertii qui est là surtout pour développer le goût et la texture du fromage dans la première partie de l’affinage - Bien des points me semblent merveilleux - un en particulier - Si on examine une vieille culture ou le milieu nutritif a été consommé - on s’aperçoit que toutes les hyphes de Geotrichum se sont transformées en des dizaines de milliers d’ arthrospores - attendant une année ou plus des conditions meilleures - ( la plante s’est totalement transformée en « graines » ) De même le Pénicillium a développé des chaînes sans fin de conidies si lourdes qu’ elles tombent dans le milieu immergé - utilisant jusqu’aux dernières molécules de substances nutritives pour assurer une hypothétique survie de l’espèce.

Bonjour jean- marie j' ai repris l'observation des feuilles et par chance je crois avoir trouver la maniére dont se deroule le processus : On constate que la formation se fait à partir des petits poils 2 procédés sont en place : -1-L ‘ « ampullisation » par dilatation progressive de l’ ampoule situé à la base du poils - on remarque sur l’ image la partie distale du poil qui va se détacher -2-Le soufflage – un peu comme la formation d ‘ un vase par le souffleur de verre . Sous l’ effet du poids ces vésicules doivent se détacher - une partie reste accrochée entre les poils et une partie doit tomber en particulier celles qui se développent directement sur le limbe de la feuille - restent donc surtout celles qui se sont formées sur les tiges - emprisonnées par les poils adjacents . amicalement

Bonsoir jean- marie Les vésicules me posent problème - elles sont bien présentes sur toutes les orties que j ai examiné - avec des prélèvements à divers endroits d’ une grande prairie. Par contre je ne trouve pas de littérature sur le sujet qui fasse mention de ces vésicules - et rien sur le Net et je ne connais pas assez la botanique pour définir l’ espèce . En fait ces vésicules disparaissent si on faite une préparation histologique classique ; elles semblent visible uniquement grâce à l ‘episcopie sur un examen directe . Si quelqu ‘ un pouvait nous aider Amicalement

Comment fonctionnent ces armes Les vésicules se cassent si on les comprime – avec une micro aiguille ( (pour electro-sclérose utilisée ici ) j’ ai posé une vésicule sur l’avant bras sans la casser - il ne se passe rien –si on appuie dessus - malgré sa très petite taille une vive brûlure apparaît et persiste ( faire cela sous bino ) Les poils - cassent très facilement mais de 2 manières * **Les petites épines elles semblent peu active dans le processus - trop souples elles plient et ne cassent pas **Les poils intermédiaires cassent à leur pointe . Si la section se fait au niveau de l’ ampoule , l’ampoule se vide – ce qui n ‘ apparaît pas souvent le cas à l observation **Les gros poils - pénètrent très bien la peau- ( sous bino on les voit s’ enfoncer dans le doigts sans presque rien sentir de douloureux - une minime piqûre au plus - avec précaution et en respectant l’angle d’entrée on fait ressortir l’aiguille elle est intacte et il ne s’est rien passé. Par contre si l’aiguille a pénétré et qu il y a un mouvement de glissement ,la sensation de brûlure est immédiate et puissante - En fait ce mouvement latéral infime a ouvert l’ampoule et le contenu de la vésicule s’est rependu sur la peau Ampoule pleine Ampoule en partie vide (la force de capillarité en ne permettant pas la vidange totale) L’action urticante est due au liquide contenu dans la base des poils. Il comprend de l'acide formique ( produit projeté par les fourmis ) , de l’histamine, de l’acétylcholine, de la sérotonine et des leucotriènes7. Il reste cependant un mystère car les brûlures d’ ortie peuvent durer des heures voire des jours - ce qui n’ est pas compatible avec la durée de vie des molécules citées – il reste donc des molécules algogénes intervenant sur notre système nerveux à découvrir Conclusion pratique - comment manipuler une ortie (en se faisant piquer raisonnablement) pour épater sa copine. La coupe d’une feuille nous montre que la densité des gros poils et des poils intermédiaires est plus important sur la face ventrale que sur la face dorsale - la tige quant à elle est la mieux armée en gros poils agressifs . Il faut donc prendre l ortie en utilisant le dessus des feuilles comme s’il s’agissait d’un mouchoir . Pour en savoir plus sur l’ortie Réf : une très belle photo ++ http://www.photomacrography.net/forum/viewtopic.php?t=13753&highlight=urtica+dioica Réf : http://fr.wikipedia.org/wiki/Grande_ortie Réf : http://urticamania.over-blog.com/article-un-memoire-consacre-a-l-ortie-prime-par-un-jury-agricole-51761286.html

La grande ortie (Urtica dioica L.) - Petit reportage sur son armement Comment fait-elle pour nous piquer où nous brûler quand on vient à son contact ? Quelles sont les armes dont dispose cette plante : à l’examen on en trouve 4 1 Les petits poils urticants - ce type de poils montre 2 zones : le poils proprement dit et à la base une zone ampullaire liquidienne 2 Les poils intermédiaires la structure est plus complexe - au sommet on découvre une pointe - style de silice - puis un tube creux ayant une paroi de sel de calcium qui assure la rigidité de l’ ensemble - enfin une dilatation ampullaire 3 Les poils de grande tailles : ce poil est caractérisé par sa taille supérieur à la précédente de plus de la moitie - et surtout remarquable par le volume de sa base et l’ aspect épineux agressif – on trouve les 3 zones ; épine de silice - tube creux et ampoule A la base par contre on constate nettement une zone de transition entre l’ampoule et le tube 4 Les vésicules : celles ci – sont disposées le long de la tige principale et le long des armatures de la feuilles - leur présence est surtout très nette sur les jeunes orties - Celles qui font le plus mal -

Bonsoir Mpx La barre en ouche : 27330 est un petit village à 12 kilomètres de Broglie - J ‘ y suis le médecin depuis 34 ans La réalisation de petites études est un grand plaisir - et pouvoir les partager ensuite grâce au forum augmente encore celui-ci. –La présentation d’ un sujet sur le site force à peaufiner ce que l on désire montrer et de ce fait devient un facteur de progrès . Bien cordialement

(X 400 – CP) On assiste aussi à un bourgeonnement des conidies dans le milieu (X 800 - fond clair –Bleu de méthylène) – Taille 12-27µm sur 4,5 – 8 µm Donc on constate 3 modes de multiplications -conidies qui se forment sur les hyphes aériens et donnent des chaînes de spores -Athrospore par division de l’hyphe dans le milieu immergé qui se met aussi à bourgeonner comme dans la photo ci-dessus -bourgeonnement des spores dans le milieu immergé – comportement identique à celui des levures. ( ce qui pose un problème de taxonomie qui n’est pas résolu ) Il s ‘agit de Moniliella probablement Suaveolens variété nigra Cette moisissure est responsable du développement de taches noires sur le fromage si le fabriquant n’a pas bien maîtrisé les paramètres de fabrication On peut lire sur le sujet qu elle a été décrite en 1961 sous le nom de Geotrichum suaveolens - et renommée en 1972 par Lindner : Moniliella Suaveolens Cette moisissure est très lipophile et osmophile c’est à dire qu elle résiste bien a des milieux à charge osmotique très élevée - on la trouve dans la margarine ,dans les produits laitiers et comme ici sur le fromage . Réf Moisissures utiles et nuisibles de B Botton et col Masson Description (–schéma à la fin du texte sur le site suivant ++ http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=15683&Fields=All taxonomie sur le site suivant http://en.wikipedia.org/wiki/Moniliella - Autre taxonomie http://www.species.be/fr/56129

Bonsoir Poursuite de l’exploration microbiologique de mon fromage préféré : le camembert au lait cru ; la dernière fois nous sommes restés sur la constatation que les modifications de PH et de température permettaient de mettre en évidence sur le fromage des moisissures qui normalement ne s’ expriment pas - on a rencontré Rhizopus - Cette semaine on s ‘ intéresse à un petit timide - qui s’était placé dans un coin d’une boite de Pétri - Pour l’ identifier je l’ ai repiqué sur un milieu lacté - son développement a été entravé par un penicillium parasite - nouveau repiquage mais cette fois sur un milieu PAG ( pomme de terre agar glucose ) à 13 °c La pousse a pris très longtemps et il a fallu attendre 15 jours pour obtenir la culture suivante (cette durée a permis à plusieurs types de bactéries la création de colonies colorées) Macroscopie : le thalle est velouté - sur la photo il a une couleur un peu grise correspondant aux hyphes de la partie aérienne mais dessous la couleur est d’un noir d encre .Le revers de la boîte est de couleur noir sous la culture . Partie aérienne : cette zone est de faible hauteur L’image montre des hyphes très raides ‘(X 400 –fond clair en –bleu de méthylène) Certains hyphes n’ont pas la même terminaison : sur les hyphes dont la terminaison ressemble à un moignon (peut–on parler de macro phialide ?) se développent par bourgeonnement une ou plusieurs conidies. Cette conidie , une fois atteint un certain volume , va à son tour se mettre à bourgeonner et former ainsi une chaîne de 3 à 5 spores . Cette photo a été difficile à réaliser - la liaison hyphe et premières conidies est très fragile ; les conidies se détachent à la moindre manipulation - la solution a été de coucher en étuve à 25 °c ( pour avoir une croissance rapide )une tranche fine de la culture sur du papier collant -le fond de la photo est hétérogène du fait de la présence du papier collant Partie immergée : - On trouve une forêt d hyphes et un grand nombre de spores de formes variables -- Ce type de spores sont des Arthrospores par section directe de l hyphe . L’hyphe est septée - mais contrairement au geotrichum il n y a pas de double cloison -

Un petit schéma complémentaire pourrait être utile pour bien localiser les images

Bonsoir Jean – Marie Le colorant utilisé est le bleu de méthylène - ce colorant donne habituellement un bleu plus soutenu et plus sombre que le bleu coton - mais si on lave abondamment entre lame et lamelle avec de l’eau glycérinée ( 50%) on obtient parfois des bleus plus tendres ( - mais le résultat est souvent fruit du hasard

Bonsoir Jean- Marie

La partie immergée dans le milieu est aussi très peu développée sur une épaisseur d’à peine 1mm - au milieu de l ‘inextricable ramification des hyphes du thalle , on trouve une grande quantité de Chlamydospores -( forme de la reproduction asexuée - dite de résistance - développée à partir de filaments mycéliens Cette particularité de ne pas s’enfoncer dans le substrat permet de se débarrasser de cette moissine contaminant les milieux de culture en lavant les boites de Petrie à l’eau Grossissement 600 Il s’ agit de Rhizopus – probablement oligosporus

les Spopocytophores sont ici isolés mais il ya des endroits où ils sont en bouquet de 2 à 3 – Ils sont fixés sur de longues tiges - les stolons - Au sommet de la colonne se situe une structure en ballon le sporocyste - (100 à180 µm) Au grossissement 800 on en découvre l’architecture externe avec une membrane Les sporocytophores sont ici isolés mais il y a des endroits où ils sont en bouquets de 2 périphérique qui semble unicellulaire et l’intérieur contenant des milliers de spores Une fois ouverte on note la columelle de couleur brune - la base du sporocyste donne l impression d’ être en entonnoir Au grossissement 800 les spores sont ellipsoïdales - ici lisses souvent cabossées - - image de l’expulsion des spores ( 7 à 12 µ m ) par le sporocyste

Bonsoir tout le monde Toujours à la recherche de Penicillium camembertii j’ai refait plusieurs fois les manips - sans mettre en évidence le sujet Reprise de la préparation utilisée dans la présentation de Geotrichum Mais acidification avec divers acides ( - acétique - nitrique - sulfurique ) en fait seul l’acide lactique permet aux moisissures de se développer correctement . Divers pH entre 4 et 7 et diverses température entre 10 et 25 °c …mais toujours rien à l’horizon ….pas de camembertii Et même avec le Saint Maure de Touraine dont Mpx a trouvé des photos Par contre -la bonne nouvelle est que ces divers milieux permettent à d autres flores de s ‘exprimer Cette semaine on focalise sur une moisissure à croissance très rapide. Ensemencement au centre avec la croûte d’un camembert au lait cru On trouve comme la première fois - au centre - une pousse blanche de geotrichum mais dès le troisième jour apparaît en périphérie une zone noir qui va envahir la boite en 3 jours ( le milieu de culture normalement est rose saumon ) La partie aerienne de la moisissure est de faible hauteur environ 1mm à 2 mm En episcopie à un grossissement de 40 Deux types de Sporocystophores des translucides et des pigmentés noirs ou marrons sombres Sous grossissement X200

Bonsoir Jhaw On obtient une image identique en microscopie optique mais il est difficile d’ avoir sur une photo un si aussi bel ensemble que celui offert par le MEB Bonsoir Mpx « Cela le distingue des "peaux blanches" des camemberts industriels » Je pense qu une partie du secret est dans cette phrase J’ ai utilisé un fromage au lait pasteurisé - or ce type de fromage utilise surtout un ensemencement avec le Geotrichum Donc je vais refaire l’expérience avec un fromage au lait cru traditionnel Le geotrichum et le penicillium n’apprécient pas les même Ph et la même température - 2 paramètres à prendre en compte - On recommence la manip Les photos du Penicillium sont très belles

Segmentation d’un fragment d’hyphe Les arthrospores sont le processus de la multiplication Asexuée des Geotricum Arthrospore en germination Conclusion : le feutrage blanc du Camembert est lié au développement d’un Geotrichum ici probablement Geotrichum album. Pourtant on parle toujours du Penicillium camembertii qui doit se développer selon la tradition. Comment se débrouiller pour le faire apparaître ? Je n’ai pas encore la réponse. A suivre

Etude du Camembert Mettre un peu de camembert sous le microscope est une expérience décevante - on l’a tous constaté à nos dépend dans nos débuts - les structures superficielles ont été détériorées lors du salage et du conditionnement . D’ où la nécessité de prendre le problème autrement. D’ abord pour identifier le mycélium il est nécessaire de le cultiver Faire la préparation - lait (écrémé ou pas) UHT longue conservation - Glucose - Agar - autoclave dans la cocotte minute pendant 20 minutes -diviser dans les boites de Petri - une fois refroidie ensemencer le centre de la boite en faisant un petit trou au couteau et en le remplissant d un peu de raclure de la croûte du camembert -pH de la préparation 6 (papier PH) - dans cette expérience mise de la culture à l’étuve à 25 degrés La pousse apparaît dès les premières heures - 5 jours après on a l’image suivante Mycélium blanc - feutrage très doux et très dense -légère odeur de vieux fromage Le prélèvement d ‘un fine tranche de la préparation est réalisé–comme une tranche de gâteau - placé sur un porte objet Fixation Alcool 95 - Bleu coton lactophenole - adjonction d’ un peu de lactophenol avant de mettre la lamelle L ‘examen de la zone superficielle montre l’image suivante on constate qu il n’ existe ni conidiophore - ni conidies ( voir penicillium expansum ) - Simplement un extraodrinaire feutrage d hyphes sans aucune structure reproductrice L ‘ exploration de la zone immergée montre une prolifération considérable d’hyphes dont une bonne partie sont en cours de fragmentation Les hyphes se fragmentant donnent les Arthrospores (coloration bleu de méthylène) Segmentation d’un fragment d’hyphe

Pour que l ' exposé soit complet il est nécéssaire d' ajouter une image de la source une image de la pomme decoupée ( cela a de l' importance - il faut noter le caractére bien limité de l' atteint qui est une caracteristique de Penicillium expansum - il existe d 'autres moisissures dont l' atteinte est morphologiquement trés differente - on en repalera plus tard ) une image de la culture - l' analyse de cette culture est une clef de la determination (sa consistance - et surtout ici sa couleur - bleu verdâtre en fin de criossance mais au debut de la pousse trés bleue ciel et une image des spores

Mpx c ‘ est mon premier envoi et la prochaine fois je ferai une succession (- a suivre – suite ) comme il se doit : partir de l image de la pomme ( ou autre ) atteinte à l’ analyse de l’ image microscopique finale en passant par l aspect de la culture et du revers de la boite indispensable dans la clef de détermination ( ici l article initial écrit contenait 10 photos) - pour le dessin je vais essayer de trouver un format plus acceptable - A bientôt pour un second sujet

Jean Marie , il manque en effet un bout d ‘explication - ‘ L’ ensemencement se fait au milieu de la Boite de Petri en enlevant à la pointe couteau le volume d’un grain de mais et en remplissant le trou avec la pulpe de pomme infectée A 18° on voit dès le lendemain les hyphes se développer - à l’étuve à 25 ° c’est encore plus rapide L’extension de fait de manière plus ou moins centrifuge ( j’ai une belle photo mais j’ étais au-delà des 800 ko réglementaires ) - Mpx , les boites doivent être refermées rapidement car la contamination aérienne parasite est très intense d ès qu on s intéresse un certain temps aux moisissures dans le même endroit . Bien amicalement

Durant l’hiver la visite au fruitier permet de constater que certaines pommes se mettent à pourrir. Etude de la Pulpe contaminée L’exploration de la zone contaminée montre que les hyphes de la moisissure envahissent l ‘espace cellulaire et inter cellulaire de la pulpe A un grossissement de 400 on distingue nettement cet envahissement par les hyphes Les secrétions enzymatiques des hyphes aboutissent à une perte de l’ adhésion entre les cellules et à un modification chimique de l’ intérieur des cellules - d’où le caractère mou de la pomme pourrie et sa couleur brune . Si on regarde la préparation on découvre des conidiophores - reproduction asexuée - - avec un grand nombre de spores - ce développement est situé dans les espaces cellulaires et inter cellulaires de la pomme ( je pensais qu on ne trouvait cette forme qu’une fois le mycélium arrivé à l’ air libre – le prélèvement a bien été fait en profondeur ! ) - mais la structure des conidiophores est dans ce cas très particulière. Coloration bleu coton lactophenol (x 400) A comparer avec la forme aérienne de la fin de cette présentation (A noter qu ‘ il existe une autre manière de fabriquer les spores (forme sexuée ) au sein de la masse cellulaire –les Zygospores -mais je n’ai rien trouvé dans cette préparation - ) A qui appartiennent ces hyphes ?–Pour répondre il faut faire se développer la forme aérienne. L’enquête va commencer la fabrication du milieu PGA – méthode personnelle Cuire 200 g de pomme de terre coupée en petits carrés avec la peau dans 1 litre d’eau Durant ¼ d heure - fragmenter les morceau grossièrement et remuer puis filtrer - à travers un torchon - ramener à 1 litre en ajoutant de l’eau - Mettre ce milieu dans un bocal à stérilisation ( comme pour les conserves de haricots verts ou autres ) et stériliser à la cocotte minute durant 1 heure Après la stérilisation on prélève 500 cc – (on congèle le reste pour plus tard) et on ajoute Glucose 10 g –Agar 10 g Nouvelle autoclavage de ½ heure dans la cocotte minute - à 110 ° ( personnellement une fois le milieu autour de 50° j’ ajoute 5 cc d ’ engrais liquide pour hortensia (apport d’Azote et acidification du milieu ) Répartition du milieu dans les boites de Pétri - ou couvercle de bocaux à stérilisation Au bout de 4 jours la boite fermée étant laissée à la température de la pièce on découvre une jolie culture Avec un bistouri – on découpe de fines lanières qui sont transportées sur un porte objet et mise sur la tranche , le but est d’éviter de toucher aux structures aériennes ( la technique du drapeau de scotch sur une cure dent est aussi utilisable) Traitement directement sur la lame -Alcool 95 (agent mouillant) -Bleu coton lactophenol (laisser agir 1minute) Adjonction de Lactophenol avant de mettre la lamelle puis de comprimer un peu. Etude de l’image et mesures Thalle bleu -verdâtre Pénicille long –tête en cylindre Structure verticillée Conidiophores isolés ( 50-500µm) Lisses Metules en verticille 2 à3 (12µm) Cylindriques Phialides en verticille 2 à 4 Cylindriques ( 12µm) Conidies (+/-) elliptiques Lisses ( 3 à 5 µm) Hypothèse : Penicillium expansum (Ref : moisissures utiles et nuisibles B Boton et coll. - Masson 1990)