Dominique.

Bonsoir Poursuite de l’exploration microbiologique de mon fromage préféré : le camembert au lait cru ; la dernière fois nous sommes restés sur la constatation que les modifications de PH et de température permettaient de mettre en évidence sur le fromage des moisissures qui normalement ne s’ expriment pas - on a rencontré Rhizopus - Cette semaine on s ‘ intéresse à un petit timide - qui s’était placé dans un coin d’une boite de Pétri - Pour l’ identifier je l’ ai repiqué sur un milieu lacté - son développement a été entravé par un penicillium parasite - nouveau repiquage mais cette fois sur un milieu PAG ( pomme de terre agar glucose ) à 13 °c La pousse a pris très longtemps et il a fallu attendre 15 jours pour obtenir la culture suivante (cette durée a permis à plusieurs types de bactéries la création de colonies colorées) Macroscopie : le thalle est velouté - sur la photo il a une couleur un peu grise correspondant aux hyphes de la partie aérienne mais dessous la couleur est d’un noir d encre .Le revers de la boîte est de couleur noir sous la culture . Partie aérienne : cette zone est de faible hauteur L’image montre des hyphes très raides ‘(X 400 –fond clair en –bleu de méthylène) Certains hyphes n’ont pas la même terminaison : sur les hyphes dont la terminaison ressemble à un moignon (peut–on parler de macro phialide ?) se développent par bourgeonnement une ou plusieurs conidies. Cette conidie , une fois atteint un certain volume , va à son tour se mettre à bourgeonner et former ainsi une chaîne de 3 à 5 spores . Cette photo a été difficile à réaliser - la liaison hyphe et premières conidies est très fragile ; les conidies se détachent à la moindre manipulation - la solution a été de coucher en étuve à 25 °c ( pour avoir une croissance rapide )une tranche fine de la culture sur du papier collant -le fond de la photo est hétérogène du fait de la présence du papier collant Partie immergée : - On trouve une forêt d hyphes et un grand nombre de spores de formes variables -- Ce type de spores sont des Arthrospores par section directe de l hyphe . L’hyphe est septée - mais contrairement au geotrichum il n y a pas de double cloison -

Un petit schéma complémentaire pourrait être utile pour bien localiser les images

Bonsoir Jean – Marie Le colorant utilisé est le bleu de méthylène - ce colorant donne habituellement un bleu plus soutenu et plus sombre que le bleu coton - mais si on lave abondamment entre lame et lamelle avec de l’eau glycérinée ( 50%) on obtient parfois des bleus plus tendres ( - mais le résultat est souvent fruit du hasard

Bonsoir Jean- Marie

La partie immergée dans le milieu est aussi très peu développée sur une épaisseur d’à peine 1mm - au milieu de l ‘inextricable ramification des hyphes du thalle , on trouve une grande quantité de Chlamydospores -( forme de la reproduction asexuée - dite de résistance - développée à partir de filaments mycéliens Cette particularité de ne pas s’enfoncer dans le substrat permet de se débarrasser de cette moissine contaminant les milieux de culture en lavant les boites de Petrie à l’eau Grossissement 600 Il s’ agit de Rhizopus – probablement oligosporus

les Spopocytophores sont ici isolés mais il ya des endroits où ils sont en bouquet de 2 à 3 – Ils sont fixés sur de longues tiges - les stolons - Au sommet de la colonne se situe une structure en ballon le sporocyste - (100 à180 µm) Au grossissement 800 on en découvre l’architecture externe avec une membrane Les sporocytophores sont ici isolés mais il y a des endroits où ils sont en bouquets de 2 périphérique qui semble unicellulaire et l’intérieur contenant des milliers de spores Une fois ouverte on note la columelle de couleur brune - la base du sporocyste donne l impression d’ être en entonnoir Au grossissement 800 les spores sont ellipsoïdales - ici lisses souvent cabossées - - image de l’expulsion des spores ( 7 à 12 µ m ) par le sporocyste

Bonsoir tout le monde Toujours à la recherche de Penicillium camembertii j’ai refait plusieurs fois les manips - sans mettre en évidence le sujet Reprise de la préparation utilisée dans la présentation de Geotrichum Mais acidification avec divers acides ( - acétique - nitrique - sulfurique ) en fait seul l’acide lactique permet aux moisissures de se développer correctement . Divers pH entre 4 et 7 et diverses température entre 10 et 25 °c …mais toujours rien à l’horizon ….pas de camembertii Et même avec le Saint Maure de Touraine dont Mpx a trouvé des photos Par contre -la bonne nouvelle est que ces divers milieux permettent à d autres flores de s ‘exprimer Cette semaine on focalise sur une moisissure à croissance très rapide. Ensemencement au centre avec la croûte d’un camembert au lait cru On trouve comme la première fois - au centre - une pousse blanche de geotrichum mais dès le troisième jour apparaît en périphérie une zone noir qui va envahir la boite en 3 jours ( le milieu de culture normalement est rose saumon ) La partie aerienne de la moisissure est de faible hauteur environ 1mm à 2 mm En episcopie à un grossissement de 40 Deux types de Sporocystophores des translucides et des pigmentés noirs ou marrons sombres Sous grossissement X200

Bonsoir Jhaw On obtient une image identique en microscopie optique mais il est difficile d’ avoir sur une photo un si aussi bel ensemble que celui offert par le MEB Bonsoir Mpx « Cela le distingue des "peaux blanches" des camemberts industriels » Je pense qu une partie du secret est dans cette phrase J’ ai utilisé un fromage au lait pasteurisé - or ce type de fromage utilise surtout un ensemencement avec le Geotrichum Donc je vais refaire l’expérience avec un fromage au lait cru traditionnel Le geotrichum et le penicillium n’apprécient pas les même Ph et la même température - 2 paramètres à prendre en compte - On recommence la manip Les photos du Penicillium sont très belles

Segmentation d’un fragment d’hyphe Les arthrospores sont le processus de la multiplication Asexuée des Geotricum Arthrospore en germination Conclusion : le feutrage blanc du Camembert est lié au développement d’un Geotrichum ici probablement Geotrichum album. Pourtant on parle toujours du Penicillium camembertii qui doit se développer selon la tradition. Comment se débrouiller pour le faire apparaître ? Je n’ai pas encore la réponse. A suivre

Etude du Camembert Mettre un peu de camembert sous le microscope est une expérience décevante - on l’a tous constaté à nos dépend dans nos débuts - les structures superficielles ont été détériorées lors du salage et du conditionnement . D’ où la nécessité de prendre le problème autrement. D’ abord pour identifier le mycélium il est nécessaire de le cultiver Faire la préparation - lait (écrémé ou pas) UHT longue conservation - Glucose - Agar - autoclave dans la cocotte minute pendant 20 minutes -diviser dans les boites de Petri - une fois refroidie ensemencer le centre de la boite en faisant un petit trou au couteau et en le remplissant d un peu de raclure de la croûte du camembert -pH de la préparation 6 (papier PH) - dans cette expérience mise de la culture à l’étuve à 25 degrés La pousse apparaît dès les premières heures - 5 jours après on a l’image suivante Mycélium blanc - feutrage très doux et très dense -légère odeur de vieux fromage Le prélèvement d ‘un fine tranche de la préparation est réalisé–comme une tranche de gâteau - placé sur un porte objet Fixation Alcool 95 - Bleu coton lactophenole - adjonction d’ un peu de lactophenol avant de mettre la lamelle L ‘examen de la zone superficielle montre l’image suivante on constate qu il n’ existe ni conidiophore - ni conidies ( voir penicillium expansum ) - Simplement un extraodrinaire feutrage d hyphes sans aucune structure reproductrice L ‘ exploration de la zone immergée montre une prolifération considérable d’hyphes dont une bonne partie sont en cours de fragmentation Les hyphes se fragmentant donnent les Arthrospores (coloration bleu de méthylène) Segmentation d’un fragment d’hyphe

Pour que l ' exposé soit complet il est nécéssaire d' ajouter une image de la source une image de la pomme decoupée ( cela a de l' importance - il faut noter le caractére bien limité de l' atteint qui est une caracteristique de Penicillium expansum - il existe d 'autres moisissures dont l' atteinte est morphologiquement trés differente - on en repalera plus tard ) une image de la culture - l' analyse de cette culture est une clef de la determination (sa consistance - et surtout ici sa couleur - bleu verdâtre en fin de criossance mais au debut de la pousse trés bleue ciel et une image des spores

Mpx c ‘ est mon premier envoi et la prochaine fois je ferai une succession (- a suivre – suite ) comme il se doit : partir de l image de la pomme ( ou autre ) atteinte à l’ analyse de l’ image microscopique finale en passant par l aspect de la culture et du revers de la boite indispensable dans la clef de détermination ( ici l article initial écrit contenait 10 photos) - pour le dessin je vais essayer de trouver un format plus acceptable - A bientôt pour un second sujet

Jean Marie , il manque en effet un bout d ‘explication - ‘ L’ ensemencement se fait au milieu de la Boite de Petri en enlevant à la pointe couteau le volume d’un grain de mais et en remplissant le trou avec la pulpe de pomme infectée A 18° on voit dès le lendemain les hyphes se développer - à l’étuve à 25 ° c’est encore plus rapide L’extension de fait de manière plus ou moins centrifuge ( j’ai une belle photo mais j’ étais au-delà des 800 ko réglementaires ) - Mpx , les boites doivent être refermées rapidement car la contamination aérienne parasite est très intense d ès qu on s intéresse un certain temps aux moisissures dans le même endroit . Bien amicalement

Durant l’hiver la visite au fruitier permet de constater que certaines pommes se mettent à pourrir. Etude de la Pulpe contaminée L’exploration de la zone contaminée montre que les hyphes de la moisissure envahissent l ‘espace cellulaire et inter cellulaire de la pulpe A un grossissement de 400 on distingue nettement cet envahissement par les hyphes Les secrétions enzymatiques des hyphes aboutissent à une perte de l’ adhésion entre les cellules et à un modification chimique de l’ intérieur des cellules - d’où le caractère mou de la pomme pourrie et sa couleur brune . Si on regarde la préparation on découvre des conidiophores - reproduction asexuée - - avec un grand nombre de spores - ce développement est situé dans les espaces cellulaires et inter cellulaires de la pomme ( je pensais qu on ne trouvait cette forme qu’une fois le mycélium arrivé à l’ air libre – le prélèvement a bien été fait en profondeur ! ) - mais la structure des conidiophores est dans ce cas très particulière. Coloration bleu coton lactophenol (x 400) A comparer avec la forme aérienne de la fin de cette présentation (A noter qu ‘ il existe une autre manière de fabriquer les spores (forme sexuée ) au sein de la masse cellulaire –les Zygospores -mais je n’ai rien trouvé dans cette préparation - ) A qui appartiennent ces hyphes ?–Pour répondre il faut faire se développer la forme aérienne. L’enquête va commencer la fabrication du milieu PGA – méthode personnelle Cuire 200 g de pomme de terre coupée en petits carrés avec la peau dans 1 litre d’eau Durant ¼ d heure - fragmenter les morceau grossièrement et remuer puis filtrer - à travers un torchon - ramener à 1 litre en ajoutant de l’eau - Mettre ce milieu dans un bocal à stérilisation ( comme pour les conserves de haricots verts ou autres ) et stériliser à la cocotte minute durant 1 heure Après la stérilisation on prélève 500 cc – (on congèle le reste pour plus tard) et on ajoute Glucose 10 g –Agar 10 g Nouvelle autoclavage de ½ heure dans la cocotte minute - à 110 ° ( personnellement une fois le milieu autour de 50° j’ ajoute 5 cc d ’ engrais liquide pour hortensia (apport d’Azote et acidification du milieu ) Répartition du milieu dans les boites de Pétri - ou couvercle de bocaux à stérilisation Au bout de 4 jours la boite fermée étant laissée à la température de la pièce on découvre une jolie culture Avec un bistouri – on découpe de fines lanières qui sont transportées sur un porte objet et mise sur la tranche , le but est d’éviter de toucher aux structures aériennes ( la technique du drapeau de scotch sur une cure dent est aussi utilisable) Traitement directement sur la lame -Alcool 95 (agent mouillant) -Bleu coton lactophenol (laisser agir 1minute) Adjonction de Lactophenol avant de mettre la lamelle puis de comprimer un peu. Etude de l’image et mesures Thalle bleu -verdâtre Pénicille long –tête en cylindre Structure verticillée Conidiophores isolés ( 50-500µm) Lisses Metules en verticille 2 à3 (12µm) Cylindriques Phialides en verticille 2 à 4 Cylindriques ( 12µm) Conidies (+/-) elliptiques Lisses ( 3 à 5 µm) Hypothèse : Penicillium expansum (Ref : moisissures utiles et nuisibles B Boton et coll. - Masson 1990)